一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性

1、一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性的人细胞因子趋化素样因子1的克隆和特性研究韩文玲 娄雅欣 唐军民 张颖妹 陈英玉 马大龙 等细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。近年来，越来越多的细胞因子得以发现。本文介绍一种新的细胞因子趋化素样因子1（CKLF1）的发现和特性研究。CKLF1全长cDNA序列包括530个碱基，有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架。CKLF1与已发现的其它细胞因子没有明显的序列同源性。CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10所部分抑制。重组的CKLF1能够明显趋化嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞，同时，它能够刺激小鼠骨骼肌细胞的增殖。以上结

2、果表明CKLF1可能在炎症和骨骼肌再生过程中发挥重要作用。关键词：白细胞介素10；骨骼肌细胞；剪切；抑制性减数杂交前 言细胞因子是一群在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。总的来说，细胞因子在细胞被活化后呈一过性诱导表达，其表达受多种因素调控。细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等（1）。其中，趋化因子是结构相似的小分子蛋白质，在吸引和活化白细胞过程中起重要作用。趋化因子在蛋白质水平上含有4个保守的半胱氨酸，根据前两个半胱氨酸的相对位置不同，趋化因子可分为CXC（）、CC（）、C（）和CX3C（）4个亚家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸（2）。以前的研究表明：人前

3、单核细胞系U937细胞在PHA刺激下，能够产生多种细胞因子；而白细胞介素10能抑制多种细胞因子的产生（3）（4）。基于以上研究结果，我们设计了一条新的技术路线来发现新的细胞因子。利用抑制性减数杂交技术，从PHA刺激的U937细胞中克隆到能被IL-10所抑制的cDNA序列，其中一个序列编码一个新的分泌性细胞因子，含有CC家族趋化因子所具有的特征性结构即两个连续的半胱氨酸，并对多种白细胞具有趋化作用，该因子被命名为趋化素样因子1（CKLF1）。但是，该因子与其它CC家族趋化因子有如下区别：（1）CKLF1成熟蛋白质只有一个连续的CC结构，其羧基端没有其它的半胱氨酸；（2）CKLF1与已发现的其它C

4、C家族趋化因子没有明显序列上的同源性； （3）CKLF1至少存在其它三种不同的RNA剪切形式；（4）它对骨骼肌细胞有刺激作用。CKLF1可能代表一个新的家族的趋化因子。因此，我们将其命名为趋化素样因子1，其相应的变异体命名为CKLF2，CKLF3和CKLF4。材 料 和 方 法抑制性减数杂交（SSH）SSH的操作方法按Diatchenko报道的进行操作(5)， 用CLONTECH公司的 PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit。SSH技术把抑制性PCR(Suppression PCR)和传统的减数杂交方法相结合(16)，可用于比较两个群体的mRNA，得到在一组mRN

5、A中表达，而在另一组mRNA中低表达或不表达的基因。先将mRNA反转录为cDNA，其中含有特异表达基因的样本为tester，另一组为driver，tester和driver cDNA杂交，去除杂交体cDNA，没有形成杂交体的cDNA即是在tester中特异表达或高表达的基因，而在driver中不表达或低表达的基因。抑制性PCR在选择性扩增特异基因的同时，抑制自身的扩增，使杂交阳性率更高。在SSH操作过程中，人前单核细胞系U937细胞由本室长期传代培养。细胞培养在含10%胎牛血清 ，100U/ml青链霉素的RPMI1640培养基中。用于SSH操作的U937细胞批量培养至2×107细胞，

6、离心收集细胞, 用Hanks液洗三遍后悬于含10ng/mlPHA的10% FCS RPMI1640中, 其中一半即1×107细胞作为tester, 另一半细胞中加入终浓度为100ng/ml的IL-10作为driver。继续培养8小时后收集细胞， 提取mRNA，取2mgmRNA合成双链cDNA，用RsaI切后，将tester分为两组，在T4 DNA连接酶作用下，分别连上Adapter1和Adapter2，进行两轮杂交，杂交产物用作PCR扩增的模板。将杂交产物稀释1000倍，利用试剂盒提供的PCR引物，进行第一轮PCR，扩增27轮，然后将第一轮PCR产物稀释10倍，分别以NESTED P

7、CR引物1和 NESTED PCR引物2R进行第二轮PCR，扩增15轮，得到的扩增产物即为差异基因片段，Glassmilk回收2001600bp的片段，克隆到pGEM-T easy中，连接产物转化XL-Blue菌，选白色克隆。得到约100个克隆，随机筛选15个变大明显的克隆，纯化质粒DNA，用ALF快速测序仪进行序列分析，并在NCBI中进行序列同源性比较。生物信息学将来自PHA刺激的U937细胞文库的EST片段与GenBank TBLASTN 的EST数据库进行比较。将与CKLF1片段有高度同源性的序列（50个以上碱基，95%以上同源性），通过 EST Assembly Machine ( 进

8、行EST拼接（6）。用于CKLF1拼接的EST片段的登记号为 W38899, N95062, AA429945, AA987264, AA927461, W19056, N89912, AA516431, AA479657, AA455042, AA989129, AF151058，NM-016951，W52820。在PHA刺激的U937细胞中得到CKLF1的全长序列，测序证明EST拼接正确。CKLF1可能的信号肽切割位点分析用PcGene、Prosite软件和 Signal P server (vices/SignalP)进行分析。CKLF1的染色体定位用HTGS数据库分析（）。包含CKLF

9、1基因的两个染色体片段的登录号为AC010542和AC018557。Northern Blot分析我们对目的基因的表达情况进行了Northern Blot分析，细胞总RNA的提取用生命公司的TRIZ0LTM试剂提取。分别取20 mg tester或driver RNA，在1.5%的甲醛变性胶中电泳，通过毛细管吸引法将RNA转到尼龙膜上。探针的标记和杂交操作参照DUPONT公司Random Primer Fluorescein Labeling kit with Antifluorescein-HRP (DuPont NENÒ NELMGC-803)试剂盒说明书。标记探针的核苷酸均为来

10、源于SSH杂交得到的全长EST片段（CKLF1全长cDNA片段中的53-530位碱基）。寡核苷酸用于扩增CKLF1及其变异体的全长cDNA片段的引物为： P1 5 GCA, AGA, AGC,GGG, AAG, CCG, A 3和P2 5 GGA, AGA, ATA, CAG, AAA, TAT, GTT, TAA, TAC 3； 用于扩增CKLF1及其变异体的编码区cDNA片段以构建pCDI-CKLF1的引物为： P3 5 ATG, GAT, AAC, GTG, CAG, CCG, AAA, AT 3和P4 5 TTA, CAA, AAC, TTC, TTT, TTT, TTC, ATG,

11、C 3； 用于扩增不含终止密码的CKLF1及其变异体的cDNA片段，以构建pEGFP-N1-CKLF1, pEGFP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4的下游引物为： P5 5 CGG GAT CCA AAA CTT CTT TTT TTT CAT GC 3CKLF1表达谱分析用巢式PCR的方法对CKLF1及其变异体在各种不同组织中的表达水平进行分析，用Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels试剂盒提供的单链cDNA文库作模板，利用P1，P2和P3，P4引物，进行PCR扩增。在第一轮PCR反应中，取1µlcDNA文库作模板，反应体系为

12、25µl，进行25个循环；在第二轮PCR反应中，取1µl第一轮PCR产物作模板，反应体系为25µl，进行20个循环。取10µl第二轮PCR产物，在5%SDS-PAGE胶中电泳。质粒构建为了对CKLF1， CKLF2和CKLF4的亚细胞定位进行研究，将去终止码的相应序列克隆到表达载体pEGFP-N1中。用P3和P5引物，从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中，扩增CKLF1，CKLF2和CKLF4的cDNA序列，在P5引物中，终止码被去除，并引入BamH1酶切位点。PCR产物用Klenow酶处理为平端，然后用BamH1酶切。pEGFP-N1载体先用Eco

13、RI酶切，再用Klenow酶处理为平端，然后用BamH1酶切。酶切处理后的载体片段和目的基因片段回收后，连接得到重组质粒pEGFP-N1-CKLF1，pEGFP-N1-CKLF2和pEGFP-N1-CKLF4。用P3和P4引物从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中，扩增CKLF1的 ORF片段，克隆入pGEM-T载体中，测序。用EcoRI将插入片段释放出来，连接至经EcoRI切后，并用CIP处理后的pcDI载体中，经酶切鉴定可得到CKLF-1的正义表达载体pcDI-CKLF1。pcDI是将pcDNA3的BglI-kpnI片段与pCI的BglI-KpnI片段置换后得到的一个真核表达载体（7）。

14、转染和转染试剂在瞬时转染中， COS-7细胞在10%胎牛血清的DMEM中培养。用SuperFect转染试剂，根据说明转染COS-7细胞。48小时后，收集转染上清，用于活性分析和Western blot分析。细胞用PBS洗，甲醛固定30分钟，再用PBS洗，荧光显微镜观察。CKLF1-EGFP，CKLF2-EGFP，CKLF3-EGFP在COS-7细胞上清中的Western blot分析将pEGFP-N1，pEGFP-N1-CKLF1, pEG FP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4四种质粒分别转染COS-7细胞，48小时后，各取70µl细胞上清，进行SDS-PAGE电

15、泳，电转至尼龙膜上，与抗EGFP多克隆抗体反应，再与HRP标记的二抗反应，用化学发光的方法进行检测。趋化实验按照以前报道的方法（8），从健康成年志愿者外周血中分离嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。纯化的嗜中性粒细胞重悬于HBSS缓冲液中，细胞密度为1X106/ml；淋巴细胞和单核细胞重悬于含0.5%低内毒素BSA和20mM Hepes的1640培养液中，细胞密度分别为5X106/ml和2X106/ml。细胞趋化实验用48孔趋化小室，按照文献报道的进行（9）。小孔的下面装满COS-7细胞的转染上清，上面是各种不同类型的细胞。用于嗜中性细胞的聚炭膜孔径为3µm，趋化时间为30分钟；用于单

16、核细胞和淋巴细胞的聚炭膜孔径为5µm，趋化时间为90分钟。DNA注射和肌肉切片分析所有的实验动物均购自北京大学医学部实验动物部。将100µgpcDI-CKLF1或pcDI分别溶于100µl生理盐水中，取6-8周龄BALB/c小鼠，分别注射pcDI-CKLF1或pcDI于骨胳肌中，同时用40ms，80V电刺激，以提高质粒的摄取量（10）。10天后，处死小鼠，将注射质粒部位的肌肉取出。标本分为两部分，一部分用于常规组织学处理，分别进行Feulgen，ANAE，POX和HE染色。另外一部分用于提取RNA，进行RT-PCR分析。 结 果差异显示cDNA片段的获得利用SSH

17、技术，我们从PHA刺激的U937细胞中得到了能被IL-10所抑制表达的cDNA序列。筛选了15个插入序列大于200个碱基的克隆，测序，并在Genbank公共数据库中检索，发现其中6个克隆包括CKLF1为新基因。Northern blot分析再次证明白细胞介素10能够抑制CKLF1的表达，CKLF1约为600个碱基（见图1）。 图1. CKLF表达的Northern blot分析第2和第4泳道的RNA来自PHA刺激的U937细胞；第1和第3泳道的RNA来自PHA刺激同时IL-10抑制的U937细胞。CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10部分抑制（第1和第2泳道）。CKLF1全

18、长DNA序列克隆及其编码蛋白质的特征通过SSH技术从PHA刺激的U937细胞中获得的CKLF1片段含有多聚腺苷酸尾巴和相对少见的加尾信号ATTAAA，人趋化因子Eotaxin和TARC的加尾信号也是ATTAAA（11，12）。这表明该片段包含完整的3'非翻译区（13，14）。该片段有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架，96-98位为翻译起始密码ATG，其周边序列为GCGATGG，符合Kozak规律（15）。在Genbank数据库中检索发现，CKLF1为一个新基因；但是EST数据库检索发现,来自不同cDNA文库的多条EST序列与我们得到的序列部分相同或高度同源。通过EST延伸技术，在

19、CKLF1原有cDNA序列基础上，向5'非翻译区延长了52个碱基。Northern blot显示CKLF1与预期的大小基本相符。为证明EST拼接是否正确，我们设计了引物P1和P2，从PHA刺激的U937细胞中成功得到CKLF1的全长cDNA序列，DNA序列分析表明我们的EST拼接是正确的。CKLF1的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列如图2A所示（CKLF1在GenBank中的登录号为AF096895）。 图2. CKLF1的核酸和相应的蛋白质序列及其与TARC和STCP-1的序列比较（A）CKLF1的核酸和蛋白质序列。核酸序列为正义链，从5'到3'方向。核酸序列下为

20、相应的蛋白质序列，终止码用星号表示。（B）CKLF1的蛋白质序列与CC家族趋化因子TARC和STCP-1的比较。加深的为保守的氨基酸。CKLF1编码的蛋白质含有99个氨基酸，分子量为10.9KDa，为高度碱性的疏水性蛋白质。CKLF1蛋白没有N糖基化位点，SignalP分析发现没有典型的信号肽切割位点（16，17），转基因分析和Western blot分析发现，CKLF1可被分泌到细胞上清中。其他实验室的研究发现，一些没有前导序列的蛋白质能被分泌出来，如乳腺来源的生长抑制因子，白细胞介素1和巨噬细胞移动抑制因子2等（18）。因此，CKLF1可能利用另外一种分泌机制。CKLF1在蛋白质水平上仅与

21、线虫的amino acid permease蛋白有低水平的同源性，与其它蛋白质没有明显的同源性。CKLF1蛋白具有两个结构特性：（1）CKLF1仅有三个半胱氨酸，最后两个连续排列，具有CC家族趋化因子的结构特征；（2）BLAST检索发现，CKLF1与其它CC家族趋化因子之间没有明显同源性。但是，手工排列发现，CKLF1与两个位于16号染色体上CC家族趋化因子TARC和STCP-1在CC附近有数个关键的氨基酸相同（图2B所示）。CKLF1三个变异体的克隆化通过RT-PCR技术，我们从PHA刺激的U937细胞中得到CKLF1的全长cDNA序列，同时，得到了其它三条片段，经克隆化和序列分析后，发现它

22、们为CKLF1的三种变异体，分别命名为CKLF2（AF135380），CKLF3（AF135381）和CKLF4（AF145216）。在PHA刺激的U937细胞中，CKLF1比CKLF2，CKLF3和CKLF4的表达水平高，且该基因的表达可被IL-10所抑制，因此Northern Blot检测时只看到一条带，可能因为其它变异体丰度较低，Northern Blot敏感度不够而未能检测到。读码框架分析表明：CKLF-2 、CKLF-3和CKLF-4分别编码152个氨基酸， 67个氨基酸和120个氨基酸，它们与CKLF1有相同的氨基端和羧基端， 中间27-112为氨基酸不同， 但都有CC结构。用编码

23、最多氨基酸的CKLF2作参照， CKLF1，CKLF3和CKLF4分别缺失27-79，27-111，80-111位氨基酸（图3所示）。 图3. CKLF1、CKLF2、CKLF3和CKLF4的蛋白质序列图4.人CKLF基因内含子和外显子交界处序列及CKLF1，2，3，4结构示意图（A）人CKLF基因内含子和外显子交界处序列。外显子序列用大写字母表示；内含子序列用小写字母表示。（B）CKLF对外显子的选择性应用及CKLF1，2，3，4的结构示意图。CKLF1与其变异体有相同的氨基端和羧基端。在CKLF2蛋白质的基础上，CKLF1，CKLF3和CKLF4选择性用27-79，27-111和80-11

24、1位氨基酸。下划线序列指CKLF2和CKLF4可能的穿膜区序列CKLF基因定位和结构通过检索HTGS数据库，将CKLF2全长cDNA序列与人类基因组工作草图相比较，我们发现两个位于16号染色体上的片段与其有高度同源性。CKLF基因包括4个外显子和3个内含子。内含子和外显子交界处的序列符合真核细胞剪接规律（图4A）（19）。CKLF基因与cDNA序列比较发现，外显子1，2，3，4分别编码1-26，27-79，80-111，112-152位氨基酸（图4B）。CKLF1，2，3，4有共同的外显子1和4，选择性拥有外显子2和3。因此，它们为同一基因的不同剪接形式。CKLF1 mRNA在不同组织中的表达

25、CKLF1 mRNA在PHA刺激的U937细胞中存在不同的变异体形式。我们用RT-PCR技术分析了CKLF1及其变异体在成年及胚胎组织中的表达情况，结果发现：CKLF1及其变异体在脾脏、肺、睾丸、卵巢、外周血白细胞、胎盘、胰腺、胎脑、胎儿骨胳肌和心脏中高表达；成年人骨胳肌、肝脏、胸腺、结肠、前列腺、胎脾和胎肝中表达水平较低；而在成年人脑组织、肾脏、心脏、小肠、胎肺和胎肾中的表达几乎检测不到。在绝大多数组织中，CKLF1和CKLF2的表达水平相类似，均比CKLF4的表达水平高，而CKLF3的表达水平最低（图5所示）。 图5.人CKLF1及其变异体在各种组织中的分布（A）CKLF及其变异体在胚胎组

26、织中的表达。（B）CKLF及其变异体在成年组织中的表达。左边显示的分子量标准。CKLF1，CKLF2和CKLF4的亚细胞定位为了研究CKLF1，2，4的细胞定位，我们构建了CKLF-EGFP融合表达载体，EGFP在CKLFcDNA序列的下游，二者位于同一读码框架。将融合表达载体和空载体对照分别转染COS-7细胞。荧光显微镜下观察荧光的分布。表达对照EGFP的细胞有分布均匀的亮绿色荧光，在细胞内没有特异性亚细胞定位（图6A）；而转染CKLF1-EGFP的细胞，细胞内荧光很弱（图6B）。基于CKLF1的结构特征，可以推测大部分CKLF1-EGFP蛋白可能被分泌到细胞培养上清中。相反，CKLF2-E

27、GFP和CKLF4-EGFP主要位于细胞边缘，在细胞的其它位置，仅有很少的荧光分布（图6C和6D）。转染HEK-293细胞，也得到相似的结果，这表明CKLF1，CKLF2和CKLF4的亚细胞定位不仅局限于COS-7细胞。图6.EGFP、CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP融合蛋白的亚细胞定位EGFP位于CKLF1，CKLF2和CKLF4的羧基端，它们在同一读码框架上，瞬时转染COS-7细胞，荧光显微镜观察。（A）转染EGFP对照。（B）转染CKLF1-EGFP。（C）转染CKLF2-EGFP。（D）转染CKLF4-EGFP。放大倍数为400倍。CKLF1为分泌性表达

28、从CKLF1的亚细胞定位结果来看，我们推测CKLF1可能为分泌性表达。为证明这一点，收集COS-7细胞转染上清，进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。Western blot表明在pcDI-CKLF1-EGFP转染细胞中，有一条约38KD的特异表达带，分子量与CKLF1-EGFP融合蛋白相吻合（图7）。而在其它三组转染上清中，没有检测到特异的表达带。因此，我们可以得出以下结论：虽然CKLF1的信号肽尚有待确定，但CKLF1为分泌性蛋白，在细胞上清中检测不到CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP的存在。而且，计算机分析发现，CKLF2和CKLF4的27-79位氨基酸为高度疏

29、水性氨基酸，可能是穿膜蛋白。将CKLF2序列递交到GenBank后，发现了其他两个实验室克隆的序列，与CKLF2有相同的读码框架，其中一个的登录号为AF057306，被认为是穿膜蛋白脂，这提示CKLF2可能是穿膜蛋白。图7.应用抗EGFP多克隆抗体，在COS-7细胞上清中检测CKLFs/EGFP。第一泳道：高分子量蛋白质标准；第二泳道：EGFP；第三泳道：CKLF1/EGFP；第四泳道：CKLF2/EGFP；第五泳道：CKLF4/EGFP重组CKLF1在体外的趋化活性为了研究CKLF1的生物学活性，我们构建了CKLF1真核表达质粒pcDI-CKLF1，该质粒包括CKLF1的完整读码框架。我们将

30、pcDI-CKLF1和空载体pcDI分别转染COS-7细胞，收集细胞上清，进行趋化活性分析。重组CKLF1的趋化活性分析用穿孔移动分析法，趋化活性用趋化指数表示（趋化指数是指pcDI-CKLF1转染细胞上清组的细胞数与空载体pcDI转染细胞上清组的细胞数的比值）（20）。与pcDI转染细胞上清相比较，pcDI-CKLF1转染细胞上清对人中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞有明显的趋化活性（图8所示）。我们在果蝇S2细胞系统中得到相似的实验结果，这说明CKLF1的趋化活性不仅局限于COS-7细胞系统。CKLF1体内趋化活性我们将pcDI-CKLF1裸质粒注射到BALB/c小鼠肌肉中，10天后，取注射部

31、位肌肉组织，RT-PCR分析发现CKLF1的表达水平较高；同时，肌肉纵切，Feulgen染色，发现与空载体对照组相比，注射pcDI-CKLF1裸质粒的小鼠肌肉切片中有更多的细胞浸润。这表明CKLF1能引起白细胞的聚集或能刺激干细胞的增殖或二者兼而有之。为进一步验证CKLF1的体内趋化活性，我们又对部分肌肉切片进行POX或ANAE染色，然后用HE复染（21）。如图9D和图9F所示，许多细胞呈POX或ANAE强阳性，而在图9C和图9E中，没有发现相应的阳性细胞。众所周知，POX阳性细胞主要是嗜中性粒细胞，而ANAE阳性细胞主要为单核细胞和T淋巴细胞（22）。在细胞染色的基础上，结合形态学观察，CK

32、LF1在体内能够趋化嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，这与CKLF1的体外趋化活性一致。图8.CKLF1对白细胞的趋化作用将人外周血淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞置于趋化小室中，下面孔中加入不同稀释度的COS-7细胞转染上清。在高倍镜下，随机选5个视野，计数穿膜细胞的数量。CI：趋化指数。 图9.小鼠肌肉内注射pcDI-CKLF1引起的白细胞浸润A、C、E为注射pcDI组小鼠；B、D、F为注射pcDI-CKLF1组小鼠。注射质粒10天后，取肌肉组织，作组织切片。D和F中可见白细胞浸润。CKLF1在体内引起骨胳肌的形态学改变将肌肉组织固定后，分别作纵切片和横切片，HE染色。在表达CKLF1的肌

33、肉组织中，除了观察到多细胞浸润现象外，还发现了肌肉组织的形态学改变，如图10所示。在横切面中，CKLF1组有细胞核居中现象（图10B），而对照组没有这种现象（图10A）；在纵切面中，CKLF1组细胞核成串珠状排列（图10D）。这种现象说明肌卫星细胞被活化，肌肉处于再生状态（23）。目前，尚需进一步的实验来证明这是CKLF1的直接作用还是由被趋化细胞产生的细胞因子导致的结果。图10.CKLF1对BALB/c小鼠骨胳肌的作用裸质粒注射后10天，取肌肉组织，作纵切片和横切片，HE染色，200倍放大后镜检。表达CKLF1的肌组织切片中（B，D），可明显观察到肌纤维再生，即核居中现象。而在对照组肌肉切片

34、中，无细胞核居中现象。讨 论我们通过一种新的技术路线，成功地克隆了新细胞因子CKLF1及其三种变异体。应用这条技术路线，把其它的细胞因子产生细胞和细胞因子合成抑制抑制因子结合起来，可发现更多新的细胞因子。CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF3-EGFP转染COS-7细胞和HEK-293细胞的结果表明，CKLF1是分泌性蛋白质，而CKLF2和CKLF4为穿膜蛋白。根据计算机分析结果，我们推测CKLF1的另外一个变异体CKLF3可能与CKLF1相同，为分泌性表达，目前这部分工作正在研究之中。令人感兴趣的是，CKLF1的不同变异体可为分泌性表达，也可为跨膜蛋白。有人报道，新的CC家族

35、趋化因子Eskine，由于选择性应用5'外显子，而造成两种不同的变异体，其中之一为分泌性表达，另一种定位于细胞核（24）。对CKLF1的不同变异体而言，不同的表达形式可能是由于对27-79这段高疏水性氨基酸的选择性应用有关。从CKLF1的结构上来看，CKLF1有三个半胱氨酸，最后两个连续排列，呈CC家族趋化因子的特征性结构，第一个半胱氨酸可能位于信号肽内。CKLF1与其它趋化因子的不同之处在于它的羧基端没有其它的半胱氨酸。CKLF1基因定位于16号染色体，与CC家族趋化因子TARC和STCP-1有低水平的同源性（25）。在目前发现的所有CC家族趋化因子中，只有TARC和STCP-1定位

36、于16号染色体上，其它绝大多数CC家族趋化因子位于17染色体上。FRN是目前发现的唯一一种CX3C趋化因子，也是唯一一种膜结合型趋化因子，同样定位与16号染色体（25）。重组的CKLF1在体内外均具有广谱的趋化活性， 我们认为CKLF1可能代表一个新的家族的趋化因子，它与TARC、STCP-1和FRN在进化上可能有一定的保守性。在小鼠肌肉中表达重组的CKLF1，可刺激肌肉细胞的增殖和分化，这与IGF-1对成年小鼠趾长伸肌的作用一致（27）。我们推测CKLF1可能通过以下几种机制来调控骨胳肌细胞的再生：第一，与IGF-1相同，CKLF1本身能够调控肌卫星细胞的增殖和分裂；第二，CKLF1趋化的白

37、细胞能够产生多种细胞因子，这些细胞因子能够影响肌细胞的生长；第三，CKLF1与其它细胞因子具有协同作用，刺激肌细胞的再生和肌管的形成。目前，尚需进一步的实验来证明我们的推测。总之，我们成功地克隆了一个新的细胞因子及其三种变异体。CKLF1的表达水平可被IL-10所部分抑制。功能实验证明，CKLF1具有广谱的趋化活性，并能刺激骨胳肌细胞的增殖和分化。致谢：感谢怀特博士对CKLF1命名所提的建议；感谢李凌松博士协助论文修改；感谢黄大无和钟英诚在照片处理过程中所提供的帮助；感谢范中玉对论文的输入所做的工作。这项研究工作是由国家863和973基金支持。参 考 文 献1. Nicola, N. A.,

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