蜂针对佐剂性大鼠关节炎滑膜细胞因子基因表达的影响

1、蜂针对佐剂性大鼠关节炎滑膜细胞因子基因表达的影响杨顺益 林军 邓金峰 冯淑兰 李万瑶 张宏 刘金芝(广州中医药大学，39蜂疗网，广州510407)内容提要目的:检测IL-1B、IL-6在类风湿性关节炎(RA)的表达，探讨蜂针治疗RA的作用机理。方法:将40只大鼠随机分为四组，采用PCR微板核酸杂交-ELISA方法检测滑膜IL-1B、IL-6的mRNA表达水平。结果:蜂针组和激素组IL-1B、IL-6的mRNA表达水平无显著性差异，而与模型组比较有显著性差异。结论:RA早期IL-1B、IL-6的mRNA表达水平是上调的，蜂针治疗后可以抑制其转录和表达，有利于RA病情的缓解。关键词 蜂毒疗法 类风

2、湿 IL-1BmRNA IL-6mRNA 基因表达EffectofAcupoint-apitherapyonCytokineGeneExpressionofSynovialTissuesinAdjuvantArthritisRatsYANGShunyi，LINJun，DENGJinfeng，FENGShulan，LIWanyao，ZHANGHong，LIUJinzhi(GuangzhouUniversityofTCM，Guangzhou，510407)类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其病理特征是滑膜慢性炎症。其关

3、节损伤的病理过程与细胞因子网络失调密切相关，其中白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)异常表达和失调可能是其发病的重要因素。本文采用PCR微板核酸杂交-ELISA方法1，2，观察蜂针对RAIL-1B、IL-6mRNA表达的影响。1材料与方法1.1动物处理及分组40只Wistar大鼠，雌雄各半，由中山医科大学提供。体重200+20g观察2天无异常，随机分为四组，每组10只。参照文献3，模型组:大鼠右后足趾皮内注射Freund氏完全佐剂0105mL致炎;激素组:造模后每只每日经腹腔注射012mL醋酸氢化可的松注射液(10mg/2m

4、L);蜂针组:造模后蜂针治疗每日1次，每次治疗取一个穴位;正常组:不造模。全部标本均为各组治疗21天后采取，经眼眶静脉取血后处死，切开每只大鼠右膝关节囊，切取关节滑膜组织10mg，标本处理见以下所述。选取“肾俞”、“足三里”、“命门”、“大椎”。取穴根据有关文献4并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位。以75%的酒精消毒所取的穴位，用镊子轻轻捏住蜜蜂的腰部，将其尾部对准穴位，让其自然螯入穴位后并留针10min，待毒囊中的毒液全部排入后，将毒刺拔除，每只大鼠只螯一个穴位，以上穴位轮流交替使用。PCR微板核酸杂交-ELISA试剂盒由第一军医大学生物学诊断研究中心提供;PCR仪为上海复华公司产品;

5、550型酶标仪为BIO-RAD公司产品;生物素、底物、Taq酶、dNTP、Ficoll400、辣根过氧化物酶(HRP)分别购自宝灵曼公司、华美公司和化粤公司。20SSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸三钠)、硫酸葡聚糖(PEG)、去离子甲酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)等;杂交洗液:1SSC;封闭剂:1%Ficoll400，0.5%HS-DNA、0.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1%BSA、脱脂奶粉、甘氨酸。上述溶液均由第一军医大学生物医学诊断研究中心提供。Primer软件设计引物，选用IL-1B、IL-6的特异性序列作为引物与探针，由上海生物工程公司合成。引物与探针序列见表1。表

6、1IL-1B、IL-6引物及寡核苷酸探针序列项目引物序列大鼠眼眶静脉取血后，即用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞，按Promega公司提供的试剂盒说明书操作，得到RNA沉淀，用无RNase的水溶解，紫外分光光度计A260/A280nm测定总RNA浓度和纯度，大于1.8表明纯度较好。经1%琼脂糖电泳凝胶鉴定，28S及18S条带清晰，所获RNA具有较好完整性。于-70度保存。117探针包被与封闭在37度下，用碳酸盐缓冲液(pH9.6)在微板上包被14hr，用封闭剂封闭微板孔非特异性结合位点。取滑膜组织标本用剪刀剪碎于离心管内，加23倍体积的处理液(由第一军医大学诊断研究中心研制提供)，在65度下

7、不时振摇3040min，然后在100度的环境下于12000rpm离心5min，取上清液作为模板液。119基因扩增于反应管内加入模板液4uL及反应液9uL，加反转录液9uLL，55度反应50sec，取3uL含有正义引物1、反义引物1、dNTP、Taq酶等的反应液及1B100倍比稀释液各4LL，5种浓度加入大反应管内，弹匀，上机，预变性94e50sec，循环条件:94度50sec，53度50sec，72度60sec，共循环38次，最后72度延伸3min，再取其扩增产物3uL，加入含有正义引物2、反义引物2等的反应液内，弹匀，上机，预变性94度2min，循环条件:94度50sec，53度50sec，

8、72度65sec，共循环38次，最后72度延伸3min。取最后扩增产物变性:100度水浴10min，冰浴10min，成为变性产物。110微板夹心杂交与显色取变性产物20uL、杂交液90uL、显色探针25uL，轻轻摇匀，50度杂交60min，甩净。于每孔中加入杂交洗液200uL，置室温35min，甩净，再重复2次。然后在每孔中加入wxk1辣根过氧化物酶100LL，37e30min后，甩净，每孔加入洗液200LL，置室温510min，再重复2次，每孔加入底物TMB液1滴，终止反应，并在酶标仪450nm波长测OD值。实验结果用均数+标准差表示，采用t检验，SPSS软件包处理。2结果2.1扩增片段长度

9、以提取的RNA作为逆转录反应的模板，IL-1B、IL-6mRNA最终扩增出的片段分别长为190bp和245bp，与设计的IL-1B、IL-6mRNA扩增片段长190bpwxk2和245bp相一致。见图1。2.2蜂针对滑膜IL-1B、IL-6mRNA水平的影响蜂针组能显著地抑制滑膜IL-1B、IL-6的基因表达，其结果与激素组无明显的差异。见表2。图1IL-1B、IL-6扩增片段长度表2蜂针对佐剂性关节炎大鼠IL-1B、IL-6mRNA相对表达量的影响3讨论本研究表明，滑膜中IL-1BmRNA、IL-6mRNA的基因表达在RA病理模型中是上调的，提示RA早期不仅存在IL-1B、IL-6转录增强，

10、对IL-1B、IL-6反应的敏感性亦可能增强，且与炎症程度相关，IL-1BmRNA、IL-6mRNA的表达水平具有协同性，这进一步支持了IL-1B、IL-6在炎症部位具有相互促进作用的论断，这可能是RA发病的机制之一。在RA关节腔损伤机理中，IL-1的局部生物效应发挥最为充分4。在RA早期病程中，IL-1可以扩大内皮细胞中粘连分子的表达;诱导中性细胞、单核细胞和淋巴细胞的趋化，通过诱导IL-6的合成参与免疫调节过程5，刺激成纤维样细胞的增生;IL-1尚可进一步通过滑膜成纤维细胞及关节软骨中的软骨细胞诱导PGE2及胶原酶的产生，增强破骨细胞活性，促进骨的重吸收，造成关节软骨和骨破坏，且IL-1可

11、对软骨和滑膜细胞造成直接损伤，使RA病变向中、晚期发展。IL-6是免疫反应中的四大炎症介质之一6，RA患者的炎性滑膜可释放一些细胞因子，这些细胞因子可刺激破骨细胞释放一些酸性蛋白水解酶，从而导致骨吸收和软骨钙化增加7。IL-6异常表达和失调是RA的典型特征，关节组织中IL-6主要由滑膜细胞产生，有研究表明，RA早期患者滑膜内检测到的IL-6的水平显著增高，其含量是患者血清内的280倍，提示IL-6主要在局部病灶内产生8。IL-6可刺激B细胞合成自身抗体，促进类风湿及其他细胞因子的产生9，从而加剧炎症过程，加重关节病变。蜂毒具有多种药理作用，直接或间接地抗炎止痛、调节免疫机能，并有类激素样的作用

12、。蜂针具有蜂毒和针灸的双重作用，可以活血化瘀、消肿止痛、通经活络、祛风散寒。本研究说明，用蜂针治疗RA后可以使IL-1B、IL-6的转录和表达受到抑制，使IL-1B、IL-6的基因表达下调，这对抑制RA滑膜炎症以及阻断关节软骨基质的降解和破坏是十分有利的，能起到保护关节软骨细胞的作用。其疗效与激素治疗没有显著性的差异。参考文献1ManzanoM.DevelopmentofaPCRmicroplate-capturehybridizationmethodforsimplefastandsensitivedetectionofSalmonellaserovarsinfood.MolCellProb

13、es，1998，12:2272CrosP.OligonucleotidegenotypingofHLApolymorphismonmicrotitreplates.Lancet，1992，340:8703李仪奎，等.中药药理实验方法学.上海:上海科学技术出版社，1991，3054ArendWP，DayerJM.Cytokinesandcytokineinhibitorsorantagonistsinrheumatoidarthritis.ArthritisRheum，1990，33:3055PelletierJP，McCollumR，CloutierJM，etal.Synthesisofmetalloproteasesandinterleukin6(IL-6)inhumanosteoarthriticsynovialmembraneisanIL-1mediatedprocess.JRheumatol，1995，43(Suppl):1096孙凌云.分子风湿病学.呼和浩特:内蒙古人民出版社，1997，24267EinhornTA.Neutralproteasesinregeneratingbone.ClinOrthop，1991，262:2868汤慧华，等.IL-6及TNF-a在类风湿关节炎发病机制中的作用.中华风湿病学杂志，1998，2(4):2389K