高效液相色谱法测定沙棘提取物中总黄酮含量

1、药品质量与检验高效液相色谱法测定沙棘提取物中总黄酮含量张荣泉张蓉(天津医药科学研究所天津300070摘要目的:应用反相高效液相色谱法测定沙棘提取物中总黄酮含量。方法:用外标法, 以Shim -pack O DS 为固定相, 甲醇0. 4%磷酸(6050 为流动相, 检测波长为370nm, 流速为1. 0ml/min 。结果:槲皮素含量测定的线性范围为0. 6163. 080 g (r =0. 9996, n =5 , 平均回收率为99. 26%, RSD =0. 80%(n =5 。结论:本法操作简便, 快速、准确。关键词沙棘提取物总黄酮高效液相色谱法中图分类号:R927. 2文献标识码:A

2、文章编号:1006-5687(2001 03-0065-02沙棘为胡颓子科沙棘属H ipp op hae L 的植物。文献报道1, 沙棘果、叶及全株均含有丰富的黄酮类化合物, 而叶中的黄酮含量明显高于果实。已被鉴定的有槲皮素、异鼠李素、山萘酚及其甙类、芦丁等。它们的药理作用逐渐为医药界所认识。目前, 沙棘总黄酮的含量测定方法不一, 但多是测定游离的异鼠李素、槲皮素或仅测定芦丁和游离的异鼠李素、槲皮素作为总黄酮含量2, 我们分析比较了大量的水解和未水解样品的硅胶G 薄层色谱和液相色谱图, 发现水解后样品中几种甙元含量均明显增加。因此, 我们采用了两步试验方法进行测定, 其结果准确度高, 重现性好

3、, 可操作性强。1仪器与试药岛津10A 高效液相色谱仪, 紫外检测器SPD 10A vp, 柱温箱CT O 10A vp, 积分仪C R 8A ; A E 240电子分析天平(瑞士梅特勒 ; 槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所提供 。沙棘提取物样品、样品(南开大学提供 ; 甲醇为色谱纯, 其余试剂均为分析纯。2方法与结果2. 1色谱条件色谱柱:岛津Shim -pack vp -O DS 5 m 250L (mm ×4. 6(i, d ; 流动相:甲醇0. 4%磷酸(6050 ; 流速1. 0ml/min; 检测波长370nm; 柱温30; 定量方法为外标法。在此实验条件下, 槲皮素

4、、异鼠李素、山奈酚得到较好分离, 理论板数按槲皮素计算为2696, 测得的对照品与样品色谱图见图1、图2。2. 2标准曲线的制备精密称取槲皮素对照品约3mg 于50m l 量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度。分别精密吸取1、2、3、4、5ml 置10ml 量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀。精密吸取10 l 进样, 以进样量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线。结果表明, 当槲皮素进标量在0. 06160. 3080 g 范围内与其峰面积呈良好线性关系(见表1 , 回归方程为Y =4. 505×10-6X +0. 140, r =0. 9996。2. 3样品制备沙棘提取物, 经硅

5、胶G 薄层色谱分析(以氯仿甲醇甲酸=910. 5为展开剂, 10%硫酸乙醇液为显色剂 , 样品中有部分甙类和甙元色谱斑点, 样品中只有甙类斑点, 而看不出有甙元显色。因此, 对两样品采用不同 的制备方法。图1槲皮素标准品色谱图a. 槲皮素b. 山萘酚c. 异鼠李素图2水解样品色谱图表1进样量与峰面积关系进样量( g 0. 06160. 12320. 18480. 24640. 3080峰面积111703239896370124精称沙棘提取物样品两份(A 、B 各约50mg , 样品(A 加100ml 甲醇, 精称重量, 于水浴回流提取4小时, 冷却, 补足甲醇量, 吸取上清液, 过0. 45

6、m 滤膜, 得样(A 供试液。样品(B 置250ml 圆底烧瓶中, 加甲醇20ml, 25%盐酸5ml , 水浴回流提取45分钟, 趁热过滤, 用甲醇稀释定容至50ml, 精密吸取1ml, 于5ml 量瓶中, 用甲醇稀释定容至刻度, 摇匀, 即得样(B 供试液。65天津药学2001年6月第13卷第3期, , ,精称沙棘提取物样品约50m g , 按样(B 的制备方法, 稀释定容至50ml, 得样品供试液。2. 4精密度与重现性取同一批样品(以样为例 , 精密吸取样(B 5 l, 注入色谱仪, 连续进样5次, 以水解后槲皮素峰面积为指标, 观察精密度, 结果见表2。同一批样品(以样为例 , 称取

7、5份样品, 精密吸取样(A 10 l , 样(B 5 l , 注入色谱仪, 测定峰面积观察重现性, 计算含量分别为22. 48%、23. 57%、23. 59%、24. 76%、22. 83%, x -=23. 52%, RS D =3. 8%。2. 5稳定性取同一批样品(以样为例 , 精密吸取样(B 5 l , , 注入色谱仪, 每隔一定时间进样一次, 测定峰面积, 结果见表3。表2样品进样精密度峰面积值12345平均值RS D (% 槲皮素3684953649203638833674063637483656900. 58山萘酚0. 282. 6回收率测定以槲皮素为测定指标, 分别精密称取样

8、品50mg , 加槲皮素对照品约2mg , 加甲醇20ml, 25%盐酸5ml , 水浴回流提取45分钟, 加甲醇稀释定容至50ml , 精密吸取1ml 于5ml 量瓶中, 用甲醇稀释定容至刻度, 摇匀。进样15 l 测定, 并计算回收率, 结果见表4。表3不同时间测得峰面积时间(h5876325842535853095881945864275891355868250. 32表4样品回收率样品量(mg 样品中含槲皮素量(mg 加入量(mg 测定值(m g 回收值(mg 回收率(% 50. 181. 9372. 013. 9402. 00599. 850. 311. 9422. 003. 930

9、1. 99899. 450. 671. 9562. 033. 9582. 00198. 650. 361. 9442. 023. 9682. 024100. 250. 241. 9392. 003. 9051. 96698. 3x -=99. 26%, R SD =0. 80%2. 7样品测定将样品制备项下样(A 10 l 、样(B 5 l 、样15 l, 注入色谱仪测定游离甙元含量、甙类含量、总黄酮含量, 结果见表5。表5沙棘提取物中总黄酮含量(%游离甙元含量甙类含量总黄酮含量样(A 、B 3. 8619. 9623. 82样/8. 808. 803讨论3. 1本方法用槲皮素对照品测定水解后

10、样品中的总甙元量, 减去未水解样品中游离甙元的量, 再乘以系数2. 51, 得沙棘叶中甙的含量, 加上测定出的游离甙元的量为沙棘叶中总黄酮含量。3. 2水解后样品中异鼠李素含量较高, 若分别用槲皮素、异鼠李素和山萘酚3个指标同时进行对照品测定, 结果会更合理, 但由于异鼠李素对照品无法购到, 故本文仅以槲皮素换算出含量。3. 3通过本实验提示, 不同部位的沙棘提取物(样、样 其黄酮含量可有很大差别。参考文献1吴素林. 反相HPLC 法同时测定沙棘果肉异鼠李素、槲皮素及沙棘总黄酮的含量. 沙棘, 1998, 11(4 :312付桂香. 高效液相色谱法测定沙棘叶中黄酮含量. 中国中药杂志, 199

11、7, 22(5 :299(收稿日期:2001-03-07Determination of Total Flavone in Fruit of Seabuckthorn Extracts by HPLCZhang Rongquan, Zhang Rong(T ianjin In stitute of M edical and Ph ar-m aceutical Science , T ianjin 300070ABSTRACT Objective:To determ ine th e conten t of total flavone in Fru it of Seabuck th or n e

12、xtracts b y using a revers e HPLC m ethod . M ethods :A external stan dard m ethod w ith Shim-pack ODS as fix ed phas e an d methanol-0. 4%phosph or ic acid (60:50 as mobile ph as e was us ed, Th e w aveleng th for detection w as 370nm an d the flow rate was 1. 0ml/min. Res ults:T he lin ear range for th e determ ination of qu ercetine w ere 0. 06160. 3080 g (r =0. 9996, n =5 . Th e aver-age recovery w as 99