反相高效液相色谱法同时测定穿心莲药材中穿心莲内酯和脱水穿心莲

1、反相高效液相色谱法同时测定穿心莲药材中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量【摘要】目的建立穿心莲药材中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的反相高效液相色谱含量测定方法。 方法采用kromasil C18色谱柱(250 mm4.6 mm, 5 m)，以甲醇水为流动相（6832），流速1.0 mlmin-1，紫外检测波长分别为225 nm（06min）和254 nm（612 min），室温下进样20 l。结果穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的进样量与峰面积分别在0.840 7. 6 g（r = 0.999 6）和0.120 1.1 g （r = 0.999 2）范围内呈线性关系，平均加样回收率分别为100.7%2.

2、 1%，98.2%1.0% 。结论该方法简便、准确、重现性好，在12 min内可同时测定穿心莲药材中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，可用于穿心莲药材的质量控制。 【关键词】 穿心莲药材 穿心莲内酯 脱水穿心莲内酯 反相高效液相色谱法穿心莲1Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees是爵床科植物穿心莲的干燥地上部分，别名一见喜、斩蛇草、苦草、橄榄莲, 原产亚洲热带地区。中国最初引种于广东及福建南部,现长江以南各省及山东、北京、陕西等地均有栽培。穿心莲为常用中药，具有清热解毒、凉血、消肿等功效，可用于治疗感冒发热，咽喉肿痛等症。研究2显示穿心莲的药效主要来自穿心

3、莲内酯、脱水穿心莲内酯等活性成分，其中穿心莲内酯含量最高，但由于其遇热不稳定，新制剂多以穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯共为质控标准。目前有关穿心莲中成药制剂中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量测定已有报道3，4，但往往测定成分单一、检测时间较长，且对中药材的这两种成分的含量测定研究并不多见。本实验采用超声提取，结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）法建立了穿心莲药材中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量测定方法。现报道如下。1 仪器与材料1.1 仪器、试剂及样品1.1.1 仪器岛津LC-10AT型高效液相色谱仪；SPD-10AVP紫外检测器；浙大N2000色谱工作站。1.1.2 试剂甲醇（色谱级，国药集

4、团化学试剂有限公司），超纯水（Millipore Q ，18.2 Mcm）。1.1.3 样品穿心莲药材（市售，产地为福建、广西和广东，均为茎部）；标准对照品：穿心莲内酯（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：110797-200307），脱水穿心莲内酯（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：854-9902）。2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：kromasil C18(250 mm4.6 mm, 5 m) (大连化物所)；流动相为甲醇水（6832）；检测波长：06 min用225 nm，612 min用254 nm；流速：1.0 mlmin-1；柱温：室温；进样量20 l；进

5、样前用0.22 m微孔滤膜过滤。2.2 标准对照品溶液的配制 精密称取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯标准对照品适量，用甲醇溶解，稀释后制成每毫升含穿心莲内酯0.42 mg，脱水穿心莲内酯0.06 mg的标准对照品混合溶液，备用。色谱图见图1。2.3 供试品溶液的制备 精密称取穿心莲药材（茎）粗粉0.5 g，置25 ml量瓶中，加甲醇定容，称定重量。冷浸过夜（12 h），超声提取60 min，用甲醇补足减失的重量1，摇匀，用0.22 m微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用。福建产穿心莲药材相应色谱图见图2。图1 混合标准品色谱（略）图2 穿心莲药材色谱（略）2.4 方法学考察2.4.1 检测波

6、长的选择根据穿心莲中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的紫外吸收光谱特征1，分别比较了在225 nm，254 nm及225 nm（06 min）和254 nm（612 min）的检测波长条件下两种主要成分的峰面积，结果显示分段检测值最大，故实验选择检测波长为225 nm（06 min）和254 nm（612 min）。2.4.2 提取溶剂的选择根据穿心莲两种主要成分的性质，供试品溶液分别采用石油醚、水、甲醇、乙醇提取，结果发现，采用甲醇提取峰面积明显较大。2.4.3 提取方式的选择分别比较了C18硅胶小柱处理、冷浸1 h后直接进样和冷浸1 h后再超声30 min等方式对两种主要成分峰面积的影响，结果显

7、示冷浸后再超声效果更好。2.4.4 提取时间的选择比较了冷浸1 h，3 h，6 h ，12h（过夜）后再超声30 min的提取条件对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积的影响，发现冷浸过夜（12h）后再超声30 min峰面积较大。恒定冷浸过夜（12h）的条件，超声时间增加为60，120 min，结果显示超声60 min与超声30 min相比峰面积增加明显，而超声60 min和120 min两种成分峰面积变化不大，因此选择冷浸过夜（12h）后再超声60 min。2.4.5 流动相的选择实验考察了甲醇-水系统中甲醇所占比例对分离效果的影响。如图3，甲醇所占比例从上到下依次为52%，60%，68%，75

8、%，82%，90%。结果显示，提高甲醇比例，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯出峰时间均会提前，但峰面积有所下降。综合考虑出峰时间、峰形、峰面积、分离度等因素，确定最佳比例为甲醇水（6832）。图3 色谱图（略）2.4.6 系统适用性实验根据图2所示穿心莲药材色谱图，分别计算两组分的理论塔板数、柱效、分离度，（见表1）。结果符合中国药典2005年版规定的理论塔板数以穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯计算不低于2 000的要求。表1 系统适用性结果（略）2.4.7 线性关系考察 取“2.2”项下标准对照品混合溶液1，3，5，7，9 ml于5个10 ml容量瓶中，用甲醇定容，分别进样（各进3针），以平均峰面积Y为

9、纵坐标，以进样量（ml）X为横坐标做标准曲线。穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯线性回归方程分别为 Y=135 859X+5 065.1， r = 0.999 6 ； Y=64 019X-3 469.8， r =0.999 2。线性范围分别为： 0.840 7. 6 g；0.120 1.1 g。2.4.8 精密度实验取“2.2”项下标准对照品混合溶液，连续进样5次， 记录穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯峰面积，计算得RSD均为0.5%。2.4.9 稳定性实验取福建产药材，按“2.3”项下方法制备穿心莲药材供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24，48 h进样20 l，结果测得穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯峰

10、面积的RSD分别为1.6%和3.2%，表明样品在48 h内稳定性良好。2.4.10 重现性实验取福建产药材，按“2.3”项下供试品溶液制备方法平行制备5份，分别进样，结果穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯峰面积的RSD分别为1.3%和1.8%，说明方法重现性良好。2.4.11 回收率实验精密称取穿心莲药材（福建产）粗粉0.5 g各6份，分别加入穿心莲标准对照品混合溶液适量，依法提取及测定。结果见表2。表2 回收率实验结果（略）2.4.12 样品测定结果 分别取3个批次的穿心莲药材（茎），按上述方法制备供试品溶液，进样20 l，记录峰面积，按回归方程计算见表3。表中数据说明三地药材茎中穿心莲内酯和脱水穿

11、心莲内酯的含量及组分的分布各有差异，但穿心莲内酯的含量均高于脱水穿心莲内酯（与文献5，6报道一致），且各产品两种内酯的总含量均达到了中国药典2005年版规定的不少于0.80%的要求。表3 样品测定结果（略）3 结论 本实验根据穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯紫外吸收光谱的不同，尝试在分离测定过程中改变波长，从而获得了两种成分的最大吸收。 本实验采用甲醇超声提取，结合反相高效液相色谱即可实现穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯在12 min内同时测定。与以往文献5比较，检测时间更短。 该法方法简单，操作简便，结果准确，是一种测定穿心莲药材中两种特征成分的有效方法。【参考文献】 1 国家药典委员会. 中国药典，I部S.北京：化学工业出版社，2005：189.2 徐志勇，刘启德，张银卿，等. 穿心莲软胶囊与穿心莲片的药理作用及急性毒性实验研究J. 广州中医药大学学报，2005，22（5）：401.3 黄燕萍，叶俊才，潘潇. HPLC测定复方穿心莲片中脱水穿心莲内酯的含量J.中成药，2006， 28（