生物工程实验---双水相萃取糖化酶

1、双水相萃取糖化酶一、实验目的1、了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用与意义,及其与传统溶媒萃取技 术的异同。2、加深对分配系数 K 、相比 R 、收率 Y 等基本概念的认识及相图的制作,掌握液液萃 取中基本实验技术。二、实验原理双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。 双水相系统通常是 由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成,相对于传统溶剂萃取来说, 双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境, 因而可 在萃取过程中保持生物物质的活性和构象, 而且双水相技术具有处理量大、 能耗低、 易连续 化操作和工程放大等优点。生物大

2、分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数 (K=Cb/Ct 。 在双水相系统 中有许多因素影响分配系数, 包括系统本身的因素如系统组成、 聚合物分子量、 聚合物浓度、 盐和离子强度、 pH 等,以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等,通过大量实验 研究可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配的。糖化酶亦称淀粉 -1, 4葡萄糖苷酶。这类酶作用于淀粉分子末端,从淀粉非还原性末 端顺次切开 -1, 4糖苷键,生成葡萄糖。它们也能作用于支链淀粉的 -1, 6键,但速度 较慢,因此分解产物全部为葡萄糖,作用结果使糖的还原能力迅速增高。本实验选用 PEG400-(NH42

3、SO4为双水相系统,从发酵液中萃取糖化酶。表观分配系数bt C C K =相比bt V V R =收率RKRK C V C V C V Y bb t t tt +=+=1上、下相酶总量上相酶总量式中 : C b 、 C t 分别为下、上相酶浓度(活性 ;V b 、 V t 分别为下相、上相的体积。物料衡算:加入的原液总酶活 =上相酶活 ×上相体积 +下相酶活 ×下相体积三、实验仪器与药品仪器:天平 恒温水浴 离心机 液相混合器 刻度试管 吸管 酸式滴定管等 药品:糖化酶 PEG400、 (NH4 2SO 4、 2%可溶性淀粉、 0.15M NaOH、 1M H2SO 4四、

4、实验步骤(一 、 PEG400-(NH4 2SO 4双水相系统相图的制作1. 配制 40%的硫酸铵溶液(已经配好 。在具塞三角瓶中准确称量 7.09g 左 右的 PEG400, ,再加入 5ml 水(此时体系澄清 。2. 慢慢加入 40%(NH4 2SO 4溶液 1,不断摇匀,直至试管开始出现混浊为止, 记录加入的 (NH4 2SO 4量;3. 再加入适量水 (水的加量按实验记录部分的表依次进行 , 使体系变澄清, 并继续加入 40%(NH4 2SO 4,使系统再次变混浊;4. 如此反复操作, 计算达到混浊时 PEG 和 (NH4 2SO 4在系统中的重量百分浓度, 得出 PEG 和 (NH4

5、 2SO 4的双节线图。(二双水相系统中蛋白质分配系数的测定1. 用干燥的刻度试管称取适量 PEG400,再加入适量 40% (NH4 2SO 4溶液,加 入适量水补足到 30ml , 在混合器上混匀, 再加入 1ml 酶液, 于混合器上混合 2 min 。 然后离心 5 min。2. 取出读取上、下相体积及总体积,按表二中所示的稀释倍数取样稀释后, 分别测其酶活。酶原液稀释 20倍测定。3. 酶活测定方法见后面附录。五、实验记录表一、两相图制作: 注:其中带有下划线的部分为实验过程中需要记录的数据, 其他为试验后需计算 整理的数据。其中第一次的 5ml 水即是最初加 PEG400后加入的 5

6、ml 水。 表二、双水相系统中蛋白质分配系数的测定 实验开始前要准确称量空瓶的重量,实验过程中每步加水和加硫酸铵溶液步骤必须称量总体系的重量, 另外由于 (NH4 2SO 4显碱性,易堵塞滴定管,所以要控制好流速。 六、实验结果: 1、双水相图: 其中:原液总酶活 =上相酶活×上相体积 +下相酶活×下相体积 相比bt V V R =表观分配系数bt C C K =收率 RKRK C V C V C V Y bb t t tt +=+=1上、下相酶总量上相酶总量经验小结:本次实验让我们收获了很多的同时,也暴露出一些问题,我们组在此次试验 中的主要不足是, 对双水相萃取的原理步骤了解不够, 实验过程中经常出现不知 道下一步要