血清酸性α-醋酸萘酯酶的比色测定及初步临床应用

1、血 清 酸 性 -醋 酸 萘 酯 酶 的 比 色 测 定 及 初 步 临 床 应 用 冯春来 1 黄兴富 2 范 华 21(聊城市东昌府区防疫站 2(东昌府人民医院 【摘要】 目的 建立比色测定血清酸性 -醋酸萘酯酶总活性的方法。方法 用 -醋酸萘酯为底物 , 在 37、 pH 6. 2的 酸性环境中经酶水解产生 -萘酚 , 然后与重氮试剂固蓝 B 偶联反应显色测定 。结果 最适 pH 6. 06. 4, 底物浓度为 2mmol/ L , 吸收峰波长为 520nm , 线性范围 02500U/L , 酶促反应时间为 20min , 显色反应时间为 20min , 显色稳定时间为 20min ,

2、 批内 、 批间变异系数分别为 2. 67%和 5. 1%。血红蛋白 1g/L和胆红素 172u mol/L无干扰。枸橼酸钠 、 草酸盐 、 肝素 、 E DT A -K 2常用 浓度无抑制 , 氟化钠可抑制该酶活性。标本 28 冰箱保存 7d 结果无变化。正常参考值 (n=100 为 (1645±378. 5 U/L (x-1. 96s 。结论 该方法简便实用 , 适于各级实验室开展 , 可作为评价肝细胞变性坏死、 肝纤维化、 肝脏合成功能异常的一项新的 血清学指标。【关键词】 酸性醋酸萘酯酶 ; 分光光度法 ; 肝病Mea sur ement of acid a lpha na

3、pht hyl acetate estera se in ser um by color imetr ic a ssa y a nd it s prel imina ry clinical a pplicat ion Fen g Chun lai , H uang X ing fu , Fan Hua (Dongchang epidemic prevention station , Liaoch eng , 252000【 Abstra ct 】 Objective T o es tab lish a col orimetric assay for d etecting acid alpha

4、naphthy l acetate es terase in seru m. Methods When pH w as 6. 2and temperature was 37 -naphthyl acetate was , hydrolyzed by acid alpha n aphthy l acetate esterase and it produ ced -naphthyl. T hen colorimetric ass ay was performed w ith fas t B salt diazotizati on reacti on. Results T he optimum pH

5、 was 6. 0-6.4and subs trate concentra 2 tion w as 2mmol/L. Abs orben t w av elength w as at 520nm. Linear ran ge for enzyme determination w as from 0to 2500U/L. T ime for enzymatic reaction w as 20minutes. T ime for produ ction o f color reacti on w as 20minu tes. T ime for color stabilization was 2

6、0minutes. Intra -assay C V value was 5. 1%and inter -assay CV value was 2. 67%. W hen H b concentrati on ros e up to lg/L and bilirub in to 172mol/L ,en zy matic ac 2 tivity w as not interfered. When s od ium citrate ,sodium oxalate ,heparin and EDT A -K 2was common concentration ,en zy matic activ

7、ity was n ot in terfered ,bu t N aF interfered for en zy matic activ ity. T he results d id n ot changed in seven days when sera were st ored at 2-8 in refrig erator. T he mean value in 100h ealthy subjects w as 1645±378. 5U/L(x -1. 96s . Conclusions T he meth od w as simple and usefu1. It fit

8、int o every laboratory. It sh ou ld be a new indicat or for evaluation of hepatic function.【 K ey w or ds 】 A cid alpha naph thy l acetate esterase ; C olorimetric analysis; H epatic dis ease 酸性 -醋酸萘酯酶 (aci d alpha naphthyl acetate esterase ,AN AE EC 3. 1. 1. 1 , 是一种细胞溶 酶体酶 , 主要作用于短链脂肪酸和芳香脂类使其发生水解 。

9、 由于该酶水解专一性不强 , 故又称酸性非特异性酯 酶 1-2。 AN AE 主要分布于肝 、 胰 、 肾 、 小肠 、 单核巨 噬细胞及组织细胞内 3, 过去主要用于白血病组织 化学的 鉴 别 诊断 和 淋 巴 细 胞 的 分 类等 2。血 清 A NAE 主要来源于肝脏内 B 酯酶 1。 血清 A N AE 总 活性定量测定的方法尚未见报道 , 我们在研究血清 A NAE 同工 酶 4的基 础上 , 参考 G omori S 组化 方 法 3, 建立了定量比色测定的方法并初步应用于临 床 , 取得了满意的结果 。 现将研究结果报道如下。 研究对象和方法 研究对象 正常对照为本院体检健康者

10、, 年龄 1870岁 , 男 50例 , 女 50例。各型肝炎及肝炎后肝 硬 化患者 96例 , 其中急 性肝炎 20例 , 慢 性肝炎 40例 , 肝硬化病人 36例 , 诊断按 1995年全国会议肝炎 诊断标准 。1. 2 试剂和仪器1. 2. 1 试剂 A 底物液 :2m mol/L -醋 酸萘 酯 , 称 取 20mg -醋酸萘酯 (化学纯 用 1m l 丙酮溶解后加 0. 1mol/LpH 6. 2磷酸盐缓冲液 49ml , 用力振摇助溶 , 4 避光保存可用 1周 。 B 终止液 :1.75m ol/L 醋酸 。 C 显色液 :1mmol/L 固蓝 B 盐 , 称取 50mg 固蓝

11、 B (分 析纯 加 0. 8%吐温 20100ml ,4 避光保 存可用 2周。 D 标准液 L 萘酚 , 称取 萘 酚 (分析纯 加无水乙醇 5溶解后水补足至 , 避光保存。1 1. 1:2mmol /-28. 8mg -0. ml 100 m l 41. 2. 2 原理 -醋酸萘酯为底物 , 在 37 pH 6. 2的 酸性环境中经酶水解产生-萘酚 , 然后与 重氮试 剂固蓝 B 在 pH 3. 0左右的酸性环境中偶联反应 , 形 成红色偶氮化合物 , 色泽深浅与酶活性成正比 。 1. 2. 3 操作步骤取 3支试管标上测定管、 标准管和 空白管 , 分别加血清 10、 标准液 100、

12、 蒸馏水 10, 然后 加 0. 5m l 底物液 37 水浴 20min , 取出加终止液 1ml 和显色液 1ml 混 匀 , 置 37 水浴 20min , 冷却后 7230分光光 度计比色 , 波长 520nm , 光径 0. 5cm , 以 空白管调零 , 读取测定管和标准管吸 光度 (A 。计 算 :测定管 A ÷标准管 A ×0. 2×1000÷0. 01÷20=血清酸性 -醋酸萘酯酶 (U/L 单位定义 :每升血清在 37 酶反应 1min 产生 1mol -萘酚为 1个酶活 性单位 (U/L 。2 结 果2. 1 实验条件的选

13、择 2. 1. 1 最适 pH 的选择用 0. 1m ol/L 的磷酸盐配成 pH 5. 4至 6. 8缓冲液 , 同时与 1份血标本作用 , 结果 pH 6. 06. 4时酶活性最高 , 因此选用 pH 6. 2磷酸 盐缓冲液。2. 1. 2 底物浓度的选 择将-醋酸萘酯 配成 1-6mm ol/L 浓度 , 分别对高 、 中 、 低浓度的 3份标本 同 时测定 , 反应曲线见图 1, 当底物浓度大于 2mm ol/L 时反应曲线趋于平坦 , 说明当底物浓度为 2mm ol/L 时酶促反应速度已达到最大 , 因此最终底物浓度选 择 2mm ol/L 。2. 1. 3吸收峰 用标准品和样 品最

14、终显色 物在 723O 分光光度计上从 420660nm 每隔 2nm 进行 1次测定 , 最后绘制吸收曲线 , 结果在 520nm 处有吸收 峰 。图 1 不同底物浓度与不同浓度标本的反应曲线2. 1. 4 最适样品用 量 用 5、 10、 20样 品同时测定 ,10l 样品量时 1560U/L 的样品 A 值在 0. 4左右 ,因此选择样品用量为 10l 。当 A 大于 0. 6时标本进 行稀释测定 。2. 1. 5 反应时间的选择 (1 酶促反应时间 , 采用 U L 、 5U L 、 O U L 高 、 中 、 低 3个不同浓度的样本同 时作 用 5、 、 5、 、 5、 3、 6,

15、结果 高 、 中 、 低 3种不同浓度的标本在 内反应呈直线 ,2025min 后反应呈曲线 ,25min 后 A 变化不大(见图 2 , 选择酶促反应时间为 20min 。 (2重氮偶 联显色反应时间 , 采用样本和标准同时分别进行 5、 10、 15、 20、 25、 30min 偶联显色 , 结果 20m in 时显色反 应虽尚未平衡 , 但 上升已较慢 , 因此显 色时间定为 20min 。图 2 酶促反应进程曲线2. 1. 6 显色后的室温放置时间 由于偶氮化合物对光较敏感 , 随着放置时间的延长显色会渐渐加深 , 因 此 对 样本 和标 准 显色 后放 置 时间 进 行 了每 隔

16、5min 观察吸光度 , 结果在室温放置 20min 内 A 值相 对增加小于 5%, 在 放置 30min 时 结果相对增加近 10%, 因此显色后的比色时间宜控制在 20min 之内 。 2. 1. 7终止剂浓度和显色剂中吐温 -20浓度的 选择将浓醋酸稀释成 0. 875、 1. 75、 3. 50、 5. 25m ol /L 浓度进行观察 , 结果 1. 75m ol/L (pH 3 时已能完全 中止酶促反应并且显色后色泽最鲜艳 。 将显色剂中 吐温分别配成 0. 2%、 0. 4%、 0. 6%、 0. 8%、 1%的浓 度进行观察 , 结果 0. 8%时可使 A 值控制在最佳比 色

17、范围 0. 20. 6之间 , 并且显色后稳定时间能控制 达 20min 。如不加吐温立即呈色则 A 值大于 0. 6, 而 且无法控制显色终点。2. 1. 8 底物和显色剂的稳定性配好的新鲜底物放 28 保存 , 然后每天取出恢复至室温后进行测定 , 测完后再置冰箱 , 如此反复发现第 9d 时空白管 A 值 大于 0. 1。 因此底物的稳定性在 28 时为 1周 。 同样显色剂在 14d 内稳定 。2. 1. 9反应线性将标准品配成 04000U/L 进行 测定 , 结果 02500U/L 内反应呈直线 , 直线方程为 Y=0. 0127+0. 0017,r =0. 9998。 当血清中含

18、量大于 2500U/L 时应稀释后测定 。2. 1. 10灵敏度 和精密度 灵敏度为 2U/ml , 高 、中、 低浓度的 3份 标本分别进行批内 批间 20次测 定 , 批内平均 CV 为 2. 67%; 批间平均 C V 为 5. 1%。 2. 1. 11干扰试验 血清中血红蛋白浓度达 1g/L 、 血清总胆红素达 172m ol/L 、 肝素 、 草 酸盐、 EDT A -K 2、 枸 橼酸 钠 的 常 用浓 度 对 结 果 均 无 影 响 ; 15L 的氟化钠可抑制 %左右的酶活性 ; 标本 在 保存 酶活性无明显变化 。 参考值 (= (65±35 L (x ±2

19、048/148/124/10120200min 20m i n mmol/90287d 2. 2n 1001478. u/1.96s , 性别间结果无差异 。2. 3 初步临床应用 20例急性肝炎患者结果 为 (1385±198 U/L ;40例慢性肝炎患者为 (1325±175 U/L ;36例肝炎后肝硬化患者为 (790±229 U/L 。经 方差分析和 g 检验 , 肝病病人结果都明显低于正常 人 (P <0. 01 ; 肝硬化组明显低于肝炎组和正常人 (P <0. 01 ; 急慢性肝炎组间无 显著差异 (P >0. 05 。 各病组组内阳

20、性率分别为急性肝炎 30%(6/20 、 慢 性肝炎 37. 5%(15/40 、 肝硬化 88. 9%(32/36 , 经 x2检验 , 肝硬化组阳性率明显高 于急、 慢性肝炎 组 (P <0. 01 , 急、 慢性肝炎组间阳性率无明显差异 (P > 0. 05 。3 讨 论3. 1 非 特异 性酯 酶根 据其 作用 的 pH 环境分为酸 性 、 中性 、 碱性 3种 , 主要用于细胞组化研究 , 它们作 用的底物都是 -醋酸萘酯 。 本实验是主要针对酸 性非特异性酯酶建立的测定方法 , 组化中重氮偶联 反应形成的化合物为褐色并为颗粒型沉淀 , 为了使 终产物显色后易比色 , 我

21、们根据重氮偶联反应在酸 性环境中偶联速度降低 , 稳定性增加的原理 5对显 色环境进行了改变 , 用 1. 75m ol/L 的醋酸使显 色环 境维持在 pH 3左右 , 这样最终产物的色泽较鲜艳且 无沉淀 , 有利于比色 , 另外醋酸又可起到终止酶促反 应的作用 。 显色液中 吐温的作用 是使显色反 应延 缓 , 延长显色稳定时间 , 便于比色分析 。3. 2 本法的试剂保存时间短 , 显色后稳定时间不够 长 , 这主要是因为醋酸萘酯易水解 , 固蓝 B 以及显 色后偶 氮盐对光敏 感 , 导致 稳定性差 。 故 应注意 : (1试剂需保持新鲜 , 保存不超过 1周 ; (2显色后最 好在

22、20m in 内完成比色 ; (3 标准相对较稳定 , 可绘 制标准工作曲线 , 不必每次带标准 。3. 3 初步临床应用显示 , 当肝细胞变性 、 坏死和纤 维化后 , 血清中 A NAE 的活性明显低于正常人 , 且肝 硬化病人的结果又明显低于急 、 慢性肝炎病人 。 提 示血清中该酶的活性降低与肝损坏程度呈正相关 。 因此 , 我们认为血清 AN AE 测定可作为评价肝细胞 损伤 、 肝纤维化以及肝脏合成功能异常的一项新的 血清学指标。参 考 文 献1小川和郎 . 酶组织细胞 化学技术 M.钟慈 声主译 . 上 海 :上海 医 科大学出版社 ,1989. 77-82.2王凤计 . 血液细

23、胞 学 M.第 2版 . 天津 :天津科 技出 版社 ,199o. 123-125.3龚志锦 , 詹洲 . 病理组织 制片和染色 技术 M.上海 :上 海科技 出 版社 ,1994. 321-323.4黄志华 , 周玉贵 , 刘 昌元 . 血清-醋酸萘酯酶同工 酶琼脂糖凝胶 电泳及临床应用 J.临床检验杂志 , 1998,16(3 :155-157.5华东纺织工学院 . 染料化学 M.北京 :纺织工 业版社 ,1960. 113-114.(上接 59页 理论 上溶血 标 本对 H BV DN A 的检 测有 影响 。 有研究表明 , 血红素可通过其卟啉环与 Taq 酶的不 可逆 结 合 而 抑 制 Taq 酶 活 性 , 从而 影 响 PCR 测 定 2-3。 本试验结果证实 , 同一乙肝大三阳志愿者 的溶血血清和未溶血血清的 H BV DN A 含量差 异无 显著性 (P >0. 05 , 因此认 为溶血 血清对 H BV DN A 定量测定不存在干扰作用 。 一方面可能是由于标本 中血红蛋白 (Hb 经 100 煮沸 10分钟后已经 变