外源NO供体硝普钠(SNP)对盐胁迫下水稻幼苗中叶绿素和游离

1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(10: 18491853ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9/zwxb/E-mail: xbzwDOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01849外源NO 供体硝普钠(SNP对盐胁迫下水稻幼苗中叶绿素和游离脯氨酸含量以及抗氧化酶的影响肖 强1,2 陈 娟2 吴飞华2 郑海雷2,*(1 湖北民族学院 / 湖北省生物资源保护与利用重点实验室, 湖北恩施445000; 2 厦门大学生命科学学院, 福建厦门361005摘 要: 在100 mmol

2、 L1 NaCl胁迫下, 研究了不同浓度一氧化氮供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP处理对水稻叶片叶绿素、游离脯氨酸含量, 叶片及幼根中愈创木酚过氧化酶(guaiacol peroxidase, GPX、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD、过氧化氢酶(catalase, CAT活性以及超氧阴离子产生速率等生理指标的影响。结果表明, 适当低浓度SNP 处理可以显著提高盐胁迫下水稻叶片中叶绿素和脯氨酸含量, 并明显缓解盐胁迫下叶片和幼根受到的氧化性损伤; 但在水稻幼苗不同器官, SNP调节的主要靶酶有所不同, 在叶片中促进SOD 和CAT

3、活性, 而在幼根中除SOD 和CAT 活性外, 还提高GPX 活性。 关键词: 水稻; 盐胁迫; 一氧化氮Effects of Exogenous Nitric Oxide Donor SNP on Contents of Chlorophyll and Free Proline, Activity of Antioxidative Enzyme in Rice Seedlings under NaCl StressXIAO Qiang1,2, CHEN Juan2, WU Fei-Hua2, and ZHENG Hai-Lei2,*(1 Key Laboratory of Biologica

4、l Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institutes for Nationalities, Enshi 445000, Hubei;2School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian, ChinaAbstract : In this study, the contents of chlorophyll, free proline and the activities of GPX, SOD, CAT, and the

5、producing rate ofsuperoxide radicals in rice seedlings treated with a varying concentration of SNP under 100 mmol L1 NaCl stress were investi-gated. The results showed that the contents of chlorophyll and free proline increased by treatment with low SNP concentration under salt stress. SNP alleviate

6、d significantly the oxidative damage caused by salt stress in leaf and root of rice seedlings. Differ-ent enzyme activities were regulated by SNP between leaf and root in rice seedlings under salt stress, SNP alleviated significantly the oxidative damage via promoting SOD and CAT activities in rice

7、leaf, whereas, via regulating GPX activity mainly besides promoting SOD and CAT activities in root.Keywords: Oryza sativa; Salt stress; Nitric oxide一氧化氮(nitric oxide, NO是植物中一种重要的信号分子。它在植物生长、发育、衰老、细胞程序性死亡、乙烯释放、抗病和对环境胁迫等各种不同形式的响应中发挥重要功能1-2。例如, NO诱导种子萌发和去黄化; 抑制胚轴延长3。低浓度NO 可以诱导叶片和根伸长; 高浓度下则是抑制作用4。进一步研究表

8、明NO 在植物中的某些功能与它对活性氧(reactive oxygen species, ROS代谢水平的调节密切相关, 其主要调节方式是作用于ROS 代谢酶,基金项目: 国家自然科学基金项目(30770192, 30670317, 30271065; 厦门大学“新世纪优秀人才支持计划”项目(X07115; 湖北民族学院博士启动基金项目作者简介: 肖强(1970, 男, 湖北恩施人, 博士, 研究方向为植物生理生化。Tel: E-mail: xiaoqiang761*通讯作者(Corresponding author: 郑海雷。E-mail: zhenghl如NO 可

9、作用于烟草中含血红素铁和非血红素铁的过氧化氢酶(catalase, CAT和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX, 从而可能参与对活性氧的调节5。Cheng 等6研究发现NO 很可能通过提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD的活性和降低膜脂过氧化作用来减缓缺水造成的离体水稻叶片的衰老。虽然也有NO 对盐胁迫下水稻幼苗氧化与抗氧化系统生理变化调控机制的研究7-8。但是缺乏NO 对水稻不同器官生理指标调Received(收稿日期: 2007-11-01; Accepted(接受日期: 2008-05-18. 1850作 物 学 报

10、第34卷控机制差异的报道。水稻是对盐害较为敏感的重要作物, 灌溉土壤中盐积累是限制水稻产量的主要因子。研究盐胁迫下水稻生理变化及其机制对于稻种筛选, 提高水稻适应性和产量、品质具有重要意义。本文报道外源NO 供体硝普钠(SNP对NaCl 胁迫下水稻幼苗生理的影响, 并初步探讨了相关机制。1.2.6 SOD活性的测定 参照Beauchamp 和Fridovich 13建立的方法, SOD活性分析前过Sephadex G-25柱以避免SNP 对活性测定的干扰, 以抑制氮蓝四唑(NBT在光照下被还原50%的酶量为一个酶活性单位(U。1.2.7 GPX活性的测定 参照Ruan 等14的方法, 以460

11、 nm吸光值每分钟上升0.01为一个酶活性单位(U。 1.2.8 CAT活性的测定 参照Chance 和Maehly 15的方法, 以240 nm吸光值每分钟减小0.01为一个酶活性单位(U。1.3 数据分析用SPSS 软件进行方差分析, 以Origin 软件绘制图表。1 材料与方法1.1 材料培养与处理水稻品种为佳辐占(Oryza sativa cv. “Jiafuzhan”, 种1周后用木子经0.1% HgCl2消毒, 水洗, 25浸种, 催芽。村B 溶液8水培, 温度26, 光照400 mol m2 s 1, 光/暗时间为12 h/12 h, 至两叶一心期在培养液中加入NaCl 和SNP

12、 同时进行处理。设两种盐处理, 分别为0 mmol L1和100 mmol L NaCl, 文中以salt0和salt100表示; 每种盐处理再设4种SNP 浓度, 分别为0、0.01、0.1和1.0 mmol L 1, 在文中分别以SNP0、SNP0.01、SNP0.1、SNP1表示, 共8种处理。每个处理设3个重复, 每天更换处理液1次, 在处理3 d后经测定各处理组间叶绿素含量表现出显著差异, 由此取相应时相叶片和幼根进行相关生理指标测定。 1.2 测定方法1.2.1 叶绿素含量的测定 采用80丙酮提取, Arnon法9。1.2.2 脯氨酸含量的测定 采用3磺基水杨酸提取, 酸性茚三酮比

13、色法10。 1.2.3 氧自由基华11的方法。1.2.4 酶液的制备 取0.4 g左右新鲜水稻叶片或幼根于冰浴研钵中, 加少许石英砂和10 mL预冷的酶提取液(用50 mmol L1、pH 7.8的磷酸缓冲液配制, 内含1%的PVP, 5 mmol L1的EDTA, 迅速匀浆, 4, 20 000×g 离心20 min, 取上清液备用。1.2.5 蛋白质含量的测定 采用Bradford 法12, BSA作为蛋白质标准。12 结果与分析2.1 SNP 对水稻幼苗叶片叶绿素含量和脯氨酸含量的影响叶绿素含量下降是植物遭受盐胁迫的重要特征之 一16。本研究也显示了同样特征(图1-A, 在无盐

14、情况下, 较低浓度SNP (0.01 mmol L1和0.1 mmol L1 可以显著增加水稻叶片中叶绿素含量(P <0.05。而1 mmol L1 SNP处理则显著减少了叶片中叶绿素含量。盐胁迫下, 0.1 mmol L1 SNP 处理可以显著提高叶片中叶绿素含量 (P <0.05, 高浓度SNP(1.0 mmol L1 则进一步加剧了叶片中叶绿素的丧失。在盐胁迫下植物积累脯氨酸具有一定普遍性17。由图1-B 可看出, 在盐胁迫下, 脯氨酸含量显著升高(P <0.01。在无盐情况下, 不同SNP 处理之间脯氨酸含量无差异(P >0.05, 但均较对照组(SNP0降低(

15、P <0.05。在盐胁迫下, 情况则不同, 0.1 mmol L1 SNP处理明显促进脯氨酸含量的增加, 而0.01 mmol L1和1 mmol L1 SNP处理则显著降低盐胁迫下脯氨酸含量(P <0.01。 2.2 SNP 对水稻幼苗叶片及幼根产生速率的影响从图2可见, 在无盐和有盐胁迫下, 0.01 mmol L1&SNP 处理都可以显著降低叶片中O 2产生速率(P <0.05, &1.0 mmol L1 SNP处理则显著增高了叶片中O 2产生速率 含量的测定 参照王爱国和罗广图1 SNP 对盐胁迫下水稻幼苗叶片总叶绿素(A和游离脯氨酸含量(B的影响Fi

16、g. 1 Effect of SNP on the contents of total chlorophyll (A and free praline (B in rice seedling leaf under salt stress第10期肖 强等: 外源NO 供体硝普钠对盐胁迫下水稻幼苗中叶绿素和游离脯氨酸含量以及抗氧化酶的影响 1851(P <0.05, 在无盐情况下, 0.1 mmol L1 SNP清除自由基效果更明显, 而盐胁迫下, 0.01 mmol L1 SNP可以显著降低1&叶片中O 2产生速率。在幼根中, 0.1 mmol L SNP处理显著降低盐胁迫下自由基

17、产生速率(P <0.05, 而1.0 mmol L 1 SNP处理则增加盐胁迫下自由基产生速率(P <0.05。表明SNP 清除自由基存在明显剂量效应, 即在盐害下适当低浓度SNP (0.1 mmol L1 发挥清除自由基功效, 高浓度SNP 释放的NO 本身对植物产生自由基样伤害效应。 2.3 SNP 对水稻幼苗活性氧代谢相关酶活性的影响表1显示, 在无盐处理水稻叶片中, SNP对SOD 活性表现为抑制效应, 各SNP 浓度处理组SOD 活性均显著低于 表1 SNP 对盐胁迫下水稻幼苗叶片中SOD(A、GPX(B和CAT(C活性的影响Table 1 Effects of SNP

18、on the activities of SOD(A, GPX(B, and CAT(C in leaf of rice seedlings under salt stress盐浓度Salt concentration (mmol L1图2 SNP 对盐胁迫下水稻幼苗叶片及幼根产生速率的影响Fig. 2 Effect of SNP on producing rate of superoxide radicals inleaf and root tissues of rice seedling under salt stressSNP 浓度 SNP concentration(mmol L10

19、0.01 0.1 1.0SOD 活性 SOD activity (U mg1 Pro 7.78±0.10 a 6.34±0.04 c 6.61±0.15 c 7.41±0.13 bGPX 活性 GPX activity (U mg1 Pro 48.52±3.73 c 49.33±3.53 c 67.26±4.79 b 83.01±2.90 aCAT 活性 CAT activity (U mg1 Pro 86.32±3.82 b 83.58±0.32 b 87.15±2.65 b 93.

20、40±3.02 a1000 0.01 0.1 1.08.49±0.08 c 7.02±0.10 d 9.03±0.05 b 10.35±0.04 a71.56±2.87 a 72.66±3.65 a 49.14±2.81 b 70.07±2.10 a82.53±3.87 c 80.28±0.86 c 91.87±1.93 b 105.13±0.38 a同一栏内数据后不同字母者在同一盐度内0.05水平上差异显著。Values within a column follo

21、wed by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level for same salinity.对照(P <0.05; 在盐胁迫下, 0.1 mmol L1和1.0 mmol L1 SNP 处理可以显著提高SOD 活性, 增强叶片清除自由基的能力。但对于水稻幼根, 情况则有所不同, 如表2所示, 在盐胁迫下, 0.01 mmol L1和0.1 mmol L1 SNP处理显著提高幼根SOD 活性(P <0.05, 而1.0 mmol L1 SNP处理则显著抑制SOD 活性(P

22、<0.05; GPX活性则与SOD 不同, 水稻幼根中GPX 活性超过叶片中10倍以上。在幼根中盐胁迫导致GPX 活性上升, 而SNP 处理进一步促进这种上升。各浓度SNP 处理均显著提高GPX 活性(P <0.01 (表2 。增强幼根自由基清除能力, 保护水稻根部抵御盐胁迫引起的氧化性损伤。CAT 活性变化比较复杂, 表1显示, 在水稻叶片中, 无盐处理下, SNP处理对CAT 活性无明显影响, 仅1.0 mmol L1 SNP处理显著提高CAT 活性(P <0.05; 但在盐表2 SNP 对盐胁迫下水稻幼苗根中SOD(A、GPX(B和CAT(C活性的影响Table 2 E

23、ffects of SNP on the activities of SOD(A, GPX(B, and CAT(C in root of rice seedlings under salt stress盐浓度Salt concentration (mmol L1SNP 浓度 SNP concentration(mmol L10 0.01 0.1 1.0SOD 活性 SOD activity (U mg1 Pro 15.38±0.27 b 16.23±0.32 b 9.80±0.50 c 17.39±0.30 aGPX 活性 GPX activity (

24、U mg1 Pro 482.79±11.30 d 686.89±16.78 c 974.88±10.46 b 1604.38±52.25 aCAT 活性 CAT activity (U mg1 Pro 40.52±2.35 c 47.85±1.05 b 66.72±4.43 a 28.64±3.21 d1000 0.01 0.1 1.014.72±0.59 b 17.49±0.62 a 17.21±0.60 a 13.90±0.48 b818.17±21.91 c

25、874.47±23.76 c 1144.69±15.19 b 1555.90±55.26 a50.91±4.50 b 55.00±6.38 b 88.34±2.33 a 87.17±3.47 a同一栏内数据后不同字母者在同一盐度内0.05水平上差异显著。Values within a column followed by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level for same salinity.1852作 物

26、学 报 第34卷胁迫下, 0.1 mmol L1和1.0 mmol L1 SNP处理均显著提高CAT 活性(P <0.05, 表明SNP 促进的CAT 活性升高增强了叶片对盐胁迫引起的活性氧清除能力。对于无盐处理的水稻幼根, 如表2所示, 0.1 mmol L1 SNP处理显著提高CAT 活性(P <0.05, 而1.0 mmol L1 SNP处理则显著抑制CAT 活性(P <0.01; 另一方面, 盐胁迫显著提高幼根CAT 活性(P <0.01, 与此同时, 各浓度SNP 处理均显著提高CAT 活力(P <0.05, 从而增强了水稻幼根对抗盐胁迫所致氧化性损伤的

27、能力。3 讨论SNP 普遍作为NO 的外源供体, Delledonne等1发现0.5 mmol L1SNP大约释放2.0 mol L1NO。Beligni 和Lamattina 18研究表明低浓度的NO (0.11.0 mol L1 可以减轻由除草剂导致的叶绿素丧失的程度。本研究进一步证实NO 能明显缓解盐胁迫下水稻幼苗叶绿素的降解, 对叶绿素具有保护效应, 同时证明这种保护效应存在剂量关系, 即低浓度保护, 高浓度抑制。Laxalt 等19认为NO 介导的叶绿素保护来源于对抗ROS 毒性, 保护膜的完整性。本研究表明0.1 mmol L1SNP处理下, 叶片CAT 和SOD 活性升高, 与此

28、同时, 叶绿素含量也是升高的; 进一步证实NO 能通过提高叶片中抗氧化酶活性明显缓解盐胁迫下叶绿素的降解。植物在逆境下积累脯氨酸具有一定普遍性, 脯氨酸可作为渗透调节物、膜和酶的保护物质及自由基清除剂等而对植物起保护作用17。关于脯氨酸在植物逆境应答中作为一个伤害标志或者是作为对抗逆境的抗性指标, 一直存在争论。本研究表明在SNP 处理下, 无盐处理的水稻幼苗叶片中脯氨酸含量基本不受外源NO 影响, 在盐胁迫下, 0.1 mmol L1 SNP处理明显促进了脯氨酸含量的增加, 可以缓解盐胁迫引起的渗透胁迫, 而1.0 mmol L1 SNP处理则显著降低了盐胁迫下脯氨酸含量(P <0.0

29、1, 与此同时水稻叶片自由基释放速率等氧化性损伤指标也是上升的, 我们认为脯氨酸可以作为一个抗性指标, 反应水稻在NaCl 胁迫下适应能力。本研究结果与Ruan 等14的试验结果不同, 他们在研究NO 对盐胁迫下小麦叶片氧化损伤的保护效应时, 发现在盐胁迫下, 1.0 mmol L1 SNP处理显著增加了叶片脯氨酸含量。我们推测这种区别可能是由于NO 对中度耐盐的小麦和对盐较为敏感的水稻具有不同的脯氨酸代谢调节机制。很多环境胁迫可引起植物ROS 的过量产生, 盐胁迫下, 植物叶片内的H 2O 2含量和O &202产生速率升高。SOD 、GPX 和CAT 组成植物清除活性氧自由基的保护酶

30、系统。其中, SOD可将O &2歧化为H 2O 2, 而GPX 和CAT则能清除H 2O 2。Beligni 和Lamattina 18认为, 作为一种抗氧化剂, NO可以抵消许多由ROS 介导的细胞毒害作用。正常生理情况下, 细胞质、线粒体和细胞外SOD 的催化活性可以将O &2快速歧化为H 2O 2和分子氧, 高浓度的NO可以和这种歧化反应竞争, 导致ONOO 的形成, 从而损伤蛋白质、脂、RNA 和DNA 21。在本研究中, 总体来看, 对于水稻幼苗叶片和幼根, 0.1 mmol L1 SNP处理具有明显保护效应, 而1.0 mmol L1SNP 处理则表现为伤害效应,

31、如导致盐胁迫下水稻叶片中叶绿素和脯氨酸含量下降, 自由基释放速率增加等。进一步证实了高浓度NO 对植物的伤害效应。已有研究表明, 盐胁迫可降低水稻幼苗中保护酶如SOD 、GPX 和CAT 活性22。本研究情况与此不同, 在水稻叶片中, 盐胁迫提高了SOD 和CAT 活性, 降低了GPX 活性。0.1 mmol L1 SNP处理进一步促进了SOD 和CAT 活性上升, 这与Uchida 等7研究结果相似。同时, 本研究进一步证实盐胁迫下不同浓度SNP 处理的水稻叶片中自由基产生速率和SOD 活性变化之间也具有显著正相关(R 20.986, P <0.05, 表明在盐胁迫下叶片中SOD 活性

32、受到外源NO 的调控, 从而影响叶片自由基清除能力。这与Cheng 等6对离体水稻叶片研究得到的结论具有相似性。此外, 研究还显示不同浓度SNP 处理下叶片中CAT 活性与自由基产生速率间也存在显著正相关(R 2=0.964, P <0.05, 提示CAT 也参与了盐胁迫下自由基清除, 这和Murgia 等23研究认为在拟南芥中SNP 抑制CAT 活性是不同的。另一方面, 在幼根中情况则有所不同, 盐胁迫提高了SOD 、GPX 和CAT 三种保护酶的活性, 且GPX 活性超过叶片10倍以上, 表明在幼根中, GPX可能是更为重要的抗氧化酶。0.1 mmol L1 SNP处理全面促进了SO

33、D 、GPX 和CAT 三种保护酶活性的进一步上升, 增强了幼根的抗氧化能力。植物中NO 的产生主要有4种途径, 即类似动物NOS 蛋白、NR 催化、其他酶促反应如亚硝酸盐NO 还原酶(Ni-NOR和黄嘌呤氧化酶(XO催化以及非酶促反应24; 此外在植物中其他酶促反应催化NO 产生也得到证实, 如质膜结合酶、细胞色素P450、亚铁血红素蛋白、辣根过氧化物酶均可催化相应底物生成NO, 植物中NO 来源的多样性与产生途径的多样性似乎存在相似之处4。在本研究中, 适当浓度SNP 处理提高了盐胁迫下水稻叶片中SOD 和CAT 活性, 减轻了氧化性损伤。而幼根中, 适当浓度SNP 处理在提高盐胁迫下SO

34、D 和CAT 活性的同时, 更显著提高了GPX 活性, 从而显著减轻幼根受到的氧化性损伤。表明外源NO 对水稻抗氧化系统的调节存在明显的器官异质性。考虑到水稻基因组测序工作已经完成, 进一步鉴定水稻不同部位NO 合成的主导途径, 从调节水稻内源NO 合成途径关键酶活性着手, 通过生物工程技术调控这些酶活性水平进而调控内源NO 水平, 对于有效提高水稻耐盐水平具有重要实践意义。References1 Delledonne M, Xia Y J, Dixon R A, Lamb C. Nitric oxide functions asa signal in plant disease resist

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