反相高效液相色谱法测定不同溶媒煎煮生化汤中阿魏酸的含量

1、反相高效液相色谱法测定不同溶媒煎煮生化汤中阿魏酸的含量 作者：王雁梅 邢志霞 史恒军 王保秀【摘要】 目的比较不同溶媒煎煮的生化汤中阿魏酸含量的变化。方法采用反相高效液相色谱法进行测定。结果不同溶媒煎煮对阿魏酸的溶出率有影响（P0.01），其中以用黄酒、童便各半煎煮，阿魏酸煎出量最高。结论 生化汤的传统煎煮方法具有合理性。 【关键词】 阿魏酸 生化汤 溶媒 反相高效液相色谱法Abstract：ObjectiveTo compare the contents of ferulic acid in Shenghuatang decocted in different solvent. Method

2、sThe contents of ferulic acid were determined by RP?HPLC. ResultsDecocting in different solvent had influence on the contents of ferulic acid and the contents were the highest in Shenghuatang decocted in solvent containing half millet wine and half childish urine. ConclusionThe traditional method of

3、 decocting herbs is reasonable.Key words：Ferulic acid; Shenghuatang; Solvent; RP?HPLC 生化汤是明末清初名医傅青主创立的妇科常用方剂，由当归24 g，川芎9 g，桃仁6 g，炮姜2 g，炙甘草2 g组成，具有活血化淤、温经止痛的功效,主治产后恶露不行，少腹冷痛等症。生化汤常用水煎服，或酌加黄酒适量同煎；而在傅青主女科?产后编医书中，原方记载用黄酒、童便各半煎服1。为了探讨传统煎煮方法的科学性与合理性，本实验以生化汤中主要药物当归、川芎的有效成分阿魏酸（图1）为检测指标24，采用RP-HPLC法测定其含量，比较不

4、同溶媒煎煮生化汤中阿魏酸的煎出量变化。现报道如下。图1 阿魏酸化学结构（略）1 仪器与试剂 美国Waters公司高效液相色谱仪，600泵，996光电二极管阵列检测器，7725i手动进样器，M32色谱工作站，Waters在线脱气系统，Digital586计算机，SZ?93自动双重纯水蒸馏器（上海荣华生化仪器厂）。 阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号0773?9910）；甲醇（分析纯，天津市化学试剂二厂）；冰醋酸（分析纯，开封化学试剂总厂）；水为自制新鲜双蒸水。 药材各饮片均购自唐都医药中药房，经浙江医药高等专科学校中药系杨雄志副教授鉴定，当归为伞形科植物当归Angelica sinens

5、is （Oliv.） Diels. 的干燥根；川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎；桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica（L.） Batsch. 的干燥成熟种子；炮姜为姜科植物姜Zingiber officinaLe Rosc.的干燥根茎的炮制加工品；炙甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎的炮制加工品。样品凭证保存于我科。 黄酒为市售浙江绍兴县第三酒厂生产，童便为24 h内所收集的1名1.5岁健康男童中段尿液。2 方法与结果2.1 色谱条件及系统适用性实验对阿魏酸对照品的甲醇溶液进行紫

6、外扫描显示，在234 nm和321 nm处紫外吸收较强。由于在321 nm处有最大吸收且干扰少，故选择321 nm为检测波长。固定相为日本GL Sciences公司Inertsil ODS3 C18反相柱（250 mm4.6 mm，5 m），C18预柱（大连化学物理研究所）；流动相为甲醇1%冰醋酸水溶液（ 4555，v/v）；流速1.0 ml?min-1；柱温为室温。进样量20 l。 理论塔板数按阿魏酸计算，不低于3 000，阿魏酸与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5。2.2 对照品溶液和供试品溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备精密称取阿魏酸对照品0.36 mg，甲醇溶解后，用流动相定容于1

7、0 ml棕色容量瓶中，得36.0 mg?L-1对照品贮备溶液。从中精密量取适量，用流动相配成浓度为0.6，1.2，2.4，4.5，9.0，18.0，36.0 mg?L-1的系列标准工作液。2.2.2 生化汤的制备1号煎液 按原方准确称取各味药共43 g，混匀后置于1 000 ml烧杯中，第1次加水360 ml，室温下浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min，用4层医用纱布滤过，残渣加水270 ml重复以上过程，合并两次滤液，浓缩至100 ml，每毫升药液含0.43 g生药。 24号煎液 按原方准确称取各味药组成3剂，分别置于3个1 000 ml烧杯中，溶媒的添加见表1，余煎煮方法同1号煎液，

8、即采取相同的浸泡时间、煎煮火候、煎煮时间、第2次相同的加水量及浓缩方法，得到100 ml药液，每毫升药液含0.43 g生药。 另按1号煎液操作制备不含当归、川芎的水煎液作为阴性对照液。表1 生化汤不同煎液中溶媒的选择（略）2.2.3 样品的制备分别精密量取以上各煎液145 l于10 ml离心管中，加入流动相4 855 ml，电动混匀3 min，4 000 r?min-1离心5 min，取上清分别过0.25 m微孔滤膜后，取续滤液备用。此得到14号样品及阴性对照液，作为供试品溶液。2.3 HPLC测定2.3.1 标准工作曲线的绘制分别精密吸取阿魏酸系列标准液20 l，注入高效液相色谱仪，测定。以

9、对照品峰面积（Y）为纵坐标，以对照品溶液浓度（mg?L-1，X）为横坐标，绘制标准工作曲线。所得回归方程为：Y84 840.72X6 658.3（r0.999 9，n6）。结果表明，阿魏酸在0.636.0 mg?L-1范围内呈良好线性关系。最低检测限为0.58 ng（S/n3）。2.3.2 精密度、稳定性与回收率实验精密吸取对照品低、中、高3个浓度，在24 h内测定其日内精密度，在6d内测定日间精密度，结果平均日内精密度RSD2.08%（n5），平均日间精密度 RSD1.56%（n5）。 精密吸取同一份样品（1号样品）20 l，分别间隔一定时间进样，测定5次，结果48 h内RSD1.45%。

10、精密吸取已测定含量的1号样品 (3.64 mg?L-1)，分别加入一定量的对照品溶液，电动混匀后，4 000 r?min-1离心5min，取上清分别过0.25 m微孔滤膜后，20 l进样，测定，平均回收率为102.3%，RSD1.2%。2.3.3 样品测定精密吸取14号样品及阴性对照液各20 l，分别进样3次，按外标法计算FA含量，并推算出每升煎液中FA含量，所得结果见表2，其色谱图见图2。实验结束，采用完全随机设计的单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学处理（P0.01），组间差异采用t检验。a?脖曜佳?品 b?采?化汤煎液 c?惨跣远哉找? 1.阿魏酸图2 色谱图（略）3

11、讨论 观察生化汤中不同溶媒煎煮对阿魏酸含量的影响已有文献5报道，溶媒选用水和黄酒，得出最好的煎煮方法为:第1次加水200 ml,黄酒100 ml，第2次加水100 ml 。我们在此基础上，进一步观察了传统傅氏煎煮方法（即采用黄酒、童便各半煎煮）与常用水煎煮或酌加黄酒适量煎煮进行了比较。结果表明，不同溶媒煎煮的生化汤中，阿魏酸的溶出量存在显著差异（P（黄酒童便水）（黄酒水）水；（黄酒童便）、（黄酒童便水）与水煎组比，均可显著提高汤剂中阿魏酸溶出量（P3，P40.05）。中医中药理论认为，黄酒味苦甘辛温，有通血脉、缓急止痛行药势之功；童便性味咸凉，归肺、肝、肾经，无毒，功效滋阴降火，止血消淤。本草

12、纲目载：“酒有开佛郁而消沉积，通膈噫而散寒饮，治泄疟而至冷痛。”重庆堂随笔指出：“童子小便，最是滋阴降火妙品，故为血证要药。”可见用黄酒、童便代水煎药是能够增加或协同其发挥疗效的。本实验从化学成分分析的角度，为古方传统煎煮的溶媒选择提供了科学依据，说明了古方溶媒选择的合理性。同时也提示我们，如果方便仍应用传统的煎煮方法。表2 生化汤不同煎液中阿魏酸含量的测定（略）与1号生化汤水煎液比较,1)P0.01；n=3 采用不同溶媒煎煮，生化汤中阿魏酸含量变化的原因，可能为不同溶媒存在不同助溶现象。阿魏酸化学名称为4-羟基-3-甲基肉桂酸，弱酸，不溶于水。黄酒是用糯米或粳米酿成的，含乙酸15%20%，尚

13、含糖类、脂类、矿物质等成分。尿液pH值为6.07.0呈中性，含有尿素、尿酸等有机质。采用童便、黄酒煎煮，在弱酸性环境中，阿魏酸更容易析出，即发挥药剂阶段配伍效应。 本实验在文献36基础上，调整流动相比例，甲醇1%冰醋酸水溶液比为4555时，在选定的色谱条件下，阿魏酸得到较好的分离，无杂峰干扰测定，其保留时间为10.0 min左右，14 min可完成一次测定。对样品的处理，采用流动相稀释后，离心，过滤，上清直接进样，避免了有机溶剂萃取的影响，具有简单、快速、无毒等特点。【参考文献】 1 段富津,李 飞,尚炽昌. 方剂学M.北京：人民卫生出版社, 1997：202.2 Ozaki Y, Ma JP. Inhibitory effects of tetramethylpyrazine and ferulic acid on spontaneous movement of rat uterus in situJ.Chem Pharm Bull, 1990，38(6)：1620.3 王 鹰,殷放宙,王元山. RP-HPL法测定生化汤丸中阿魏酸含量J. 南京