Westernblot贼拉

1、Western-Blot操作流程1. 试剂配制1.1母液 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml1.1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20保存。1.1.3 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500m

2、l溶解后，高压灭菌，室温保存。1.1.4 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO ·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。1.1.5 10SDS SDS 10g蒸馏水至 100ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。1.1.6 10过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4保存，保存时间为1周。（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）1.1.7 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW12

3、1.14) 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。1.1.8 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。1.1.9 40Acr/Bic（37.5:1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100ml溶解后4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。1.1.10 30Acr/Bic（29:1） 丙稀酰胺（Acr） 29g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水

4、至 100ml溶解后4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。1.1.11 20Tween20 Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4保存。1.2 使用液配制 单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438g TritonX-100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后4保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。一般实际用的比较多的其实是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方：50 mM Tris-HCl pH

5、 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。l 裂解得到的蛋白样品，由于含有较高的蛋白去垢剂干扰，不能用Brandford法测定蛋白浓度,要用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。l RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果

6、发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g蒸馏水至 2000ml1.2.3 G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg95乙醇 50ml磷酸 100m

7、l蒸馏水至 1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存。1.2.4 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g蒸馏水至 100 ml高温灭菌后，室温保存。 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后-20保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20保存。 还原型5 X SDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39gS

8、DS 0.5g溴酚蓝 0.025甘油 2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。1.2.7 电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次。（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）1.2.8 转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8gSDS 0.37g甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用35次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5

9、次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）1.2.9 10X丽春红染液 丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。 TBS缓冲液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸馏水至 1000ml（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）1.2.10 TBST缓冲液 20Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用，最好现用现配。1.2.11 封闭液 (最

10、好现配现用)脱脂奶粉（国产，光明牌） 5gTBST 100ml 洗脱抗体缓冲液（可用可不用）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巯基乙醇) 700 l（通风厨里加）SDS 2g0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml超纯水至 100ml配制时，在通风厨内进行。4保存。可重复使用1次。1.2.12 显色液PCA22l-Lum50l-1M Tris-Hcl(pH8.5)500l500lH2O2-5lH2O4.428 ml4.5 ml4显影液（5X） 自来水（加热至50） 375ml （以下药品加到温水中）米吐尔 1.55g亚硫酸钠（无水）

11、22.5g碳酸钠（无水） 33.75g溴化钾 20.95g补水至 500ml配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4保存。使用时用自来水稀释至1倍。（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）5 定影液 自来水（5060） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠 240g亚硫酸钠（无水） 15g冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g钾明矾 15g（水温冷至30以下时再加入）加水定容至 1000ml，室温保存。6 抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便

12、宜，可以多买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。7 化学发光试剂 分A和B两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合。8 40%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制组 分 10分离胶（两块胶，10ml） 4浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 4.85ml 3.16ml40Acr/Bic（37.5:1） 2.5ml 0.5ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 1.26ml10SDS

13、100 l 50 l10%AP 50 l 25lTEMED 5 l 5 l*加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）组 分 15分离胶（两块胶，10ml） 7.8浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 2.34ml 2.065ml40Acr/Bic（37.5:1） 3.75ml 0.975ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 3.75ml 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 1.875ml10SDS 100 l 50 l10%AP 50 l 25lTEM

14、ED 10l 5 l9 30%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制l SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围*丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）15 124310 16687.5 36945.0 57212*双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29。l 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液溶液成分总体积 5ml总体积 10ml总体积 15ml总体积 20ml总体积 25ml总体积 30ml6% 水2.6ml5.3ml7.9ml10.6ml13.2ml15.9ml30%丙烯酰胺1.0ml2.0ml3.0ml4.0ml5.0ml6.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3

15、ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%过硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED4l8l12l16l20l24l8%水2.3ml4.6ml6.9ml9.3ml11.5ml13.9ml30%丙烯酰胺1.3ml2.7ml4.0ml5.3ml6.7ml8.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%过硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED3l6l9l12

16、l15l18l10%水1.9ml4.0ml5.9ml7.9ml9.9ml11.9ml30%丙烯酰胺1.7ml3.3ml5.0ml6.7ml8.3ml10.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%过硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED2l4l6l8l10l12l12%水1.6ml3.3ml4.9ml6.6ml8.2ml9.9ml30%丙烯酰胺2.0ml4.0ml6.0ml8.0ml10.0ml12.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3m

17、l2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%过硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED2l4l6l8l10l12l15%水1.1ml2.3ml3.4ml4.6ml5.7ml6.9ml30%丙烯酰胺2.5ml5.0ml7.5ml10.0ml12.5ml15.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%过硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED2l4l6l8l1

18、0l12l配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液溶液成分总体积3ml总体积4ml总体积5ml总体积6ml总体积8ml水2.1ml2.7ml3.4ml4.1ml5.5ml30%丙烯酰胺0.5ml0.67ml0.83ml1.0ml1.3ml1M Tris(pH 6.8)0.38ml0.5ml0.63ml0.75ml1.0ml10% SDS30l40l50l60l80l10%过硫酸胺30l40l50l60l80lTEMED3l4l5l6l8l操作步骤一、蛋白样品制备（一） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使

19、残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10l PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于4下1

20、2000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20保存。（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200l的裂解液，按照上述操作，直接用200l裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刀刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）（二） 组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、加400l

21、 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20保存。(三) 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重

22、复洗涤一次。3、用枪吸干上清后，加100l裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20保存。二、蛋白含量的测定（一） 制作标准曲线1、从-20取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0g，2.5g，5.0g ，10.0g ，20.0g ，40.0g。3、按下表在各管中加入各种试剂。0g2.5g5.0g10.0g20.0g40.0g1mg/ml BSA2.5l5.0l10.0l20.0l40.0l

23、0.15mol/L NaCl100l97.5l95.0l90.0l80.0l60.0lG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。（二） 检测样品蛋白含量1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100l，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。4、取一管考马斯亮蓝加95l 0.

24、15mol/L NaCl NaCl溶液和5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5l样品含的蛋白量。三、SDSPAGE电泳1 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2 灌胶与上样（1）、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶，但现

25、在的灌胶模具都不用了）（2）、按前面方法配10分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）（3）、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。（4）、按前面方法配4的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气

26、泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。（5）、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中（冲洗的话个人感觉可以使用5ml的针筒，当然操作不能太粗暴了）。（6）、测完蛋白含量后，计算含20-50g 蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200l的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15l，

27、加样孔的最大限度可加20l样品）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40l，胶做得很好的话50l也是问题不大的）上样前要将样品于金属浴中煮5-10min使蛋白变性（本人心得：煮完样品后，样品会蒸发到EP 管的顶部，一定用离心机把所有样品离到管底）。（7）、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）3 电泳：电泳时间一般100min(Bio-Rad)，浓

28、缩胶电压为80V较好，到分离胶以后用120跑（新鲜的电泳缓冲液当然跑得更快一些）。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas的0441和0671比较好，就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好，不要局限于此说明）。四、转膜1 转一张膜需准备6张7.08.3cm的滤纸和1张7.38.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用（其实用无水甲醇完全浸湿，然后放到转移缓冲液中浸泡后使用，效果也不错）。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里

29、，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好）2 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。3 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上，注：个人感觉就垫1张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻

30、，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上l 另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能

31、会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）。5 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。（1.实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜）（2.硝纤膜建议使用0.22 的小孔径膜，不容易转膜过头）（