蛋白质印迹法westernblot应用介绍.

1、蛋白质印迹法（western blot技术）威斯腾生物技术中心2014. 9. 1全国免电话:400-675-675WWW.Western Biotechnology Inc-Western Blot介绍Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析Western Biotechnology Inc全国免更电话400-675-6758Western Blot 介绍Western Biotechnology Inc.全国免更电话 400-675-6758 网址:蛋白质印迹的发明者一般认为是戻国随坦扌葩丸学的乔治斯塔 克(George Stark ) 在尼尔伯奈特(Neal

2、Burnette)于 1981 年所 著的刁“亡也生今(Analytical Biochemistry )中首次被称为 Western Blot.蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或纽织 总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特 异性抗休检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用 于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等 多个方面。Western Biotechnology Inc.全国免毋电话 400-675-6758 网址:电泳昨瑤ft闭和;洗»入二统T匕隼蛋分多次将细 胞收至一个（Protein sample

3、preparation）（1）贴壁细胞蛋白样品收集° ° °A收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。 加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心 收集细胞。C将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离 心管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂 解液200 口 1于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶 使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30minoD裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至15ml EP管中，再用超声破%举仪破碎细胞后，4°C下12000rpm离 心15min,吸取上层液体于新的离心管中，

4、弃掉沉淀。Western Biotechnology Inc.全匡免西电话 400-675-6758 R目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考 马斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、BCA法等。1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、300 gg/mL （用 PBS配制）°样品液：取原液2 口 L至200 pL （用PBS配制）。2、操作：先取一块新的96孔板，于下测光密度值，取溶液/样品40pL和E液40 pL,每个浓度点均作三复孔，振 荡混匀。37° C反应10 min后，加入福林酚试剂（1: 15稀释） 160 pL,

5、振荡混匀，37° C反应30 mino 630 nm下测光密度值 以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线，计算待测样品 蛋白浓度。Western Biotechnology Inc.全国免更电话 400-675-6758 网址:全国免芟电话400 675 6758Western Biotechnology IncWestern Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-675jwww.cqwesiern.u分嵩欣浓Jl与妥匂分禽范Bl栽胶浓度(%)最住分需范谢CKD)650-150830-901020-801212-601510-401、配制下层胶（分离胶）5ml

6、10 mliSmi20wi*L?US.06.62.9ao00.0ISM Trb(pHS 8|13IS111.010HSOS060.1e.i$210HAM03aie.H0.2flM»D0.0020 004o.ooto.oos赫置lh后制上层胶（浓缩胶）2.配制上层胶（浓缩胶）,5“SmiI10 ml4.1m fMxarflui*O.t)1.0l.OM TrbfpHI040.7S10讣03O.g08OMO.M0<040.11(M£D0.00(O.OOBaoi加完后插上梳子,静置1 hWestern Biotechnology Inc.全匡免茨电话 400 675-6758

7、 Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-675jwww.cqwesiern.uWestern Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-675jwww.cqwesiern.uWestern Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-675jwww.cqwesiern.u'制胶过程注意事项：厂二操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。»加完分离胶后胶，加水液封时要很慢，否则胶会被 冲变型。»灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不 会有气泡

8、。A分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。»插梳子时要使梳子保持水平。Western Biotechnology Inc.全国免賀电话八006756758 网址www.cqweslern.冲占.' 鬲，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可.跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min;跑下层胶，100V 35Ma/块胶1 h左右.将筱胶和因相基质象三明治一样央在用缓冲液湿润滤纸间 -I纸I胶I膜I纸I 槽式湿转法将换胶和固相基质央在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中. -I海绵I纸I胶I膜I纸I海绵I +Western Biotechnology I

9、nc.400 675-6758 局址 Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758转膜H推荐：100V , 1一2,卜时；根据蛋白大小以及胶厚度的 不同而不同。转膜注意事项> 滤纸、胶、膜之间不能有气泡.> 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序.> 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下> PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。Western Biotechnology Inc全国免费电话400-675-67589转膜后检测（此步可以省略）/丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝 酸纤维素滤膜，换水几次。&

10、quot;印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋 白探针Western印迹过程。将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是便抗体与特异的 蛋白质结合.>封闭液 5 % TBST脱脂奶粉溶液（30ml ） 牛血清白蛋白溶液（BSA ）> 摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或49过夜.< Tween-20作用： 0441+性艮謝，不为抗 体与纨斥的结含°Western Biotechnology Inc.r （Primary antibody incubation）把nc膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的一 抗，室温或49在侧摆

11、摇床上缓,匮摇动孵育一小时.如果一抗 孵育一小时效果不佳，可以41缓恆摇动孵育过夜.或更据抗 体的说明选择适当的孵育温度和时间.回收一抗.加入TBST液，在侧摆摇床上缓幔摇动洗涤5-10分钟.吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次.如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤 次数。注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用 Tubu 1 in抗体或Act in抗体,进行内参检测.Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758(Secondary antibody inucubation)NC膜放在密闭塑料袋或者培养

12、皿中，加入稀释好的 荧光二抗，37 C缓幔摇动孵育一小时.二抗需根据一 抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需选 择抗小鼠IgG的二抗.Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-675DAB显色法化学发光显色法（ECL ）化学发光法（BCL）ECL显色原理：（二抗用HRP标 记）反应物为过氧化物+鲁米诺， 如果遇到HRP即发光，可使胶片曝光显形.回收二抗.加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗 涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分 钟。共洗涤3次.如果结呆背景较高可以适当延长洗涤时 间并增加洗涤次数. ECL化学发光显色比较常用，结

13、采容易控制，但是被催化是灵敏度差一点 DAB显色比较灵敏，是HRP最敏感的底物Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Blot常见问题分析Western Biotechnology Inc.全匡免费电话400-675 6影响抗原抗体反应的因素电解质-一电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因 此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。酸碱度抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般 为pH6. 0-8. 0.温 度-一温度升高可使反应加速，但温度高于569 时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。Western Biotechnology Inc.

14、全国免箜电话400-675-6758Western Biotechnology Inc.全国免箜电话400-675-6758Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758 RWestern Biotechnology Inc.全国免箜电话400-675-6758胶不平？凝胶漏液?胶板洗刷千净 加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混 合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶 聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐Western Biotechnology Inc.全国免箜电话400-675-6758Western Biotechn

15、ology Inc.> 抗体浪度过.需> 封闭不丸分> 朕没有均匀澡迄> 朕丸者圾冲液污黑> 统体与封闭射出现 夾又反应杂夾甫检测一执二执的工作滾度延长対現对间或更换封用棉朕奇用甲醇将膜丸全沒套取膜与浹水烦对要栽手 廉，更换祈埒此膜圾冲潅检测一执.二抗与耐囲#1Western Biotechnology Inc.Western Biotechnology Inc.是否力吏又反应Western Biotechnology Inc.全匡免芟电话 400-675-6758 冋址:Western Biotechnology Inc.Western Biotechnolog

16、y Inc.非特异条帑多Western Biotechnology Inc.> 抗体浓度过嵩>鎂没有均匀澡遅> 膜或舟圾冲波活柴> 封闭不克分>抗体与封用*1出现/ 杂交前检测一抗.二抗 的工作滾夂丁林膜前用100%甲瑋将膜 克全澡迄V 拿取鎂与戒水纨对要裁 手去，更换新鲜转朕皱 冲液" 检測一抗.二抗与封囲 制是否有交反应Western Biotechnology Inc.妥勺帶型条状Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6

17、758Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758>上样过査» 样嬴沉|建>> 样嬴中的污染> 制肤不佳V阵低上样*丁加大样品中的SD5浓夂丁 直心样° 确毎灌肤均匀Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Biotechnology Inc.全国免费电话400-Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Weste

18、rn Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758丁完全变性蛋白/ 确保加入足够的DTT或卩-疏基乙醇/观察指示剂染料，掌握恰当的电泳时间Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758Western Brotechnology Inc.全国免费电话400-675-6758型条带或微笑”条带Western BiotechnologY Inc全国免更电话 "006756758网址www.cqweslern.co01Western BiotechnologY Inc全国免更电话 "006756758网址www.cqweslern.co01上样体积过大导致不完 全堆积 电泳过程中电场不均匀分离胶表面不齐/使用恰当上样体积/如果蛋白浓度已知，上样时确保对称/制胶时使分离胶表面 水平West