电泳的概念带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为

1、引引 言言n电泳的概念电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（动的现象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。n电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄国年俄国物理学家物理学家ReRessss进行了世界上第一次电泳实验）。进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在但电泳技术的广泛应用，则是在19371937年用滤纸作年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳十

2、年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。域得到了广泛应用。原则上按电泳的原理来分，可分为二类：原则上按电泳的原理来分，可分为二类：n自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。贵，费时费力，不便于推广应用。n区带电泳：区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用

3、主要支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 电泳的分类电泳的分类引引 言言按按支持介质种类支持介质种类的不同，区带电泳可分为：的不同，区带电泳可分为：纸电泳纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。析。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎

4、盘：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。率高。 v以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。引引 言言淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量

5、相差很大，很难得径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。测。其分辨率较高。v聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支

6、持介质聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质引引 言言引引 言言 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：为：薄层电泳、薄层电泳、 板电泳、柱电泳板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。定量、免疫电泳。第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进

7、而达到同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。分离目的。 .若将带净电荷若将带净电荷Q Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F F引引= =E Q E Q （1）在溶液中在溶液中, ,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F F阻阻 F F阻阻=6=6r rV V 当当F F引引= =F F阻阻时时 EQ= 6EQ= 6r rV V V= V= 由上式可以看出由上式可以看出, ,粒子的移动速度粒子的移动速度( (泳动速度泳动速度V)V)与电场强度与电场强度( (E)E)和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量( (Q)Q)成正比

8、成正比, ,而与粒子的半径而与粒子的半径( (r)r)及溶液的粘度及溶液的粘度( () )成反比。成反比。非球形分子（如线状非球形分子（如线状DNADNA）在电泳过程中受到更大在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。EQEQ6 6r r（2）（3）（4） 电泳的基本原理电泳的基本原理 在一定在一定pHpH条件下，每一种分子都具有特定条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧

9、密同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 +- 由由（4 4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，了便于比较，常用迁移率常用迁移率 m m（或称泳动度，指带电粒或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示代替泳动速度表示粒子的泳动情况。粒子的泳动情况。 m =

10、V/E = Q/6m = V/E = Q/6r r （5 5） 由上式可以看出，由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。EQEQ6 6r r（4）V= 电泳的基本原理电泳的基本原理 由于蛋白质、氨基酸等的电离度由于蛋白质、氨基酸等的电离度随溶液随溶液pHpH变化变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率率U U为迁移率为迁移率m m和当时条件下电离度和当时条件下电离度的乘积。的乘积。 U = m U = m （6 6） 将（

11、将（6 6）式代入（）式代入（5 5）式得：）式得： U =U = （7 7） .Q Q.6 6r r 由由（7 7）式可以看出，）式可以看出，凡能影响溶液粘度凡能影响溶液粘度的因素的因素如如温度温度，影响分子带电量，影响分子带电量Q Q及解离度及解离度的因素如的因素如pHpH的的改变，都会对有效迁移率，产生影响。改变，都会对有效迁移率，产生影响。 电泳的基本原理电泳的基本原理 以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受电电渗渗（

12、是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。 最后要考虑选用最后要考虑选用离子强度离子强度适宜的溶液。离子强度影响粒子的适宜的溶液。离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。 总之，电泳受总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、溶

13、液粘度、温度、温度、pHpH、电渗及离子强度电渗及离子强度多种因素的影响。多种因素的影响。 第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide polyacrylamide gel gel electrophoelectropho- -resisresis，PAGEPAGE）是以是以聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对稳定，对pHpH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小

14、的特点，是一种和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体（acryacry- - lamidelamide，简称简称AcrAcr）和和交联剂交联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（methylane methylane bisacrylamidebisacrylamide，简称简称BisBis）在催化剂作用下合成的。在催化剂作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝

15、胶电泳，SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。等电聚焦电泳，双向电泳等类型。一、概述一、概述CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=OC=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH- -CHCH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-C

16、H-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰胺胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝胶的制备二、聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1 1. .化学聚合化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵过硫酸铵（ammonium ammonium persulfatepersulfate，ApAp），），此外还需要加速剂此外还需要加速剂TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺），

17、四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量它能以自由基的形式存在。微量TEMEDTEMED的加入，可使过硫酸铵形成的加入，可使过硫酸铵形成自由基：自由基： S S2 2O O8 82-2- 2SO 2SO4 4- - 这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。. 光聚合通常用光聚合通常用核黄素核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。

18、TEMEDTEMED的存在，的存在，可以加速聚合。可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响： （1 1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。合。 （2 2）低温、低）低温、低pHpH都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。 （3 3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制）

19、有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。聚合反应。2.2.光聚合光聚合 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（于凝胶总浓度（T T）和和AcrAcr与与BisBis两者之比。两者之比。凝胶总浓度（凝胶总浓度（T T）和交和交联度（联度（C C）的计算公式分别为：的计算公式分别为：T= C= T= C= 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔凝胶浓度越大，孔径越小径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断

20、。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为当凝胶浓度确定后，交联度为5%5%时，时，凝胶具有最小孔径，凝胶具有最小孔径，超过超过5%5%或低于或低于5%5%时凝胶孔径都要增大。时凝胶孔径都要增大。 三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100% 在浓度为在浓度为7.5%7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为满意的分离效果。因此，把浓度为7.5%7.5

21、% 凝胶称为标准胶。对于凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准胶或的标准胶或4%-10%4%-10% 的凝胶梯度来测试，的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%2.4%的大孔凝胶，此时凝的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入胶太软，不易操作，可加入0.5%0.5%琼脂糖，或在琼脂糖，或在3%3%凝胶中加入凝胶中加入20%20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳四、不连续聚丙烯酰胺凝胶

22、电泳 系统的不连续性表现在以下几个系统的不连续性表现在以下几个方面：方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的pHpH不不同。电极缓冲液为同。电极缓冲液为pH8.3pH8.3的的TrisTris- -甘氨甘氨酸缓冲液，浓缩胶为酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7pH6.7的的TrisTris- -HClHCl缓冲液，而分离胶为缓冲液，而分离胶为pH8.9pH8.9的的TrisTris- -HClH

23、Cl缓冲液。缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即三种物理效应，即样品的浓缩效应，样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。分辨率高。8.38.38.96.7水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽电泳条带电泳条带第三节第三节 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。种电泳方法。对于分子量较大的样品对于分子量较大的样品，如大分子核酸、，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分病毒等