病理学常用研究方法(研究生课程)（课堂PPT）

1、.1 病理学常用研究方法.2整体水平整体水平：尸体解剖尸体解剖 autopsyautopsy动物实验动物实验 animal experimentanimal experiment细胞水平：细胞水平：光镜组织切片光镜组织切片 light-microscopelight-microscope细胞培养细胞培养 cell culturecell culture流式细胞技术流式细胞技术 flow cytometryflow cytometry组织芯片组织芯片 tissue micro-arraytissue micro-array组织微切割技术组织微切割技术 micro-dissectionmicro-

2、dissection电镜电镜 透射、扫描、免疫电镜透射、扫描、免疫电镜.3蛋白水平：蛋白水平：1.1.免疫组化免疫组化 immunohistochemstryimmunohistochemstry2.Western Blotting2.Western Blotting3.3.组织芯片组织芯片 tissue micro-arraytissue micro-array基因水平：基因水平：1.1.原位分子杂交原位分子杂交( (组织、染色体组织、染色体Fish)Fish) in situ hybridization in situ hybridization2.2.基因芯片基因芯片 gene chip

3、gene chip3.3.组织芯片组织芯片 tissue micro-arraytissue micro-array4.PCR4.PCR及测序等及测序等 PCR and sequencePCR and sequence.4一、免疫组化标准化问题探讨本世纪本世纪7070年代问世年代问世抗体种类急速增加，交叉反应存在抗体种类急速增加，交叉反应存在免疫组化技术方法不断问世免疫组化技术方法不断问世使用的试剂或实验室条件不同使用的试剂或实验室条件不同操作人员的熟练程度操作人员的熟练程度病理医生的结果判定水平及关联知识病理医生的结果判定水平及关联知识解决标准化的问题势在必行解决标准化的问题势在必行.5(一

4、)方法的选择目前常用的免疫组化方法有：目前常用的免疫组化方法有：PAPPAP、ABCABC、APAAPAPAAP法、法、S-PS-P方法等方法等各种方法只要运用得好，都会得到满意各种方法只要运用得好，都会得到满意的结果的结果建议：在我们省内都采用建议：在我们省内都采用S-PS-P法法.6S-P法的优点 方法统一方法统一 有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒 一般一般2-32-3小时小时(30(30-60-60) )，而，而ABCABC法需法需1 1天，分天，分 子量小子量小(60KD)(60KD)，穿透力强，穿透力强 灵敏性高，特异性强，灵敏性高，特异性

5、强，4 4个亚基都能于二抗上的生个亚基都能于二抗上的生 物素结合，而且结合键强物素结合，而且结合键强 背景低，非特异性反应少，等电点为背景低，非特异性反应少，等电点为6.56.5，接近于，接近于 中性，不与内源性凝集素样物质结合中性，不与内源性凝集素样物质结合, ,而而ABCABC法为法为1010.7S-P法与ABC法的区别S-PS-P法：法：Streptaridin peroxidase conjugataed methodStreptaridin peroxidase conjugataed method 链霉菌素抗生物素蛋白链霉菌素抗生物素蛋白过氧化物酶连接法过氧化物酶连接法ABCABC

6、法：法： Avidin-Biotin peroxidase complex methodAvidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素亲生物素卵白素亲生物素过氧化酶复合物法过氧化酶复合物法S-PS-P法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了ABCABC方法中的卵白方法中的卵白 素和生物素素和生物素即：卵白素中的即：卵白素中的4 4个亚基一方面与第二抗体上的生物素结个亚基一方面与第二抗体上的生物素结 合，另一方面还与复合物中的生物素结合合，另一方面还与复合物中的生物素结合.8一一抗抗二二抗抗卵卵白白素素生生物物素素过过氧氧化化物物酶

7、酶A-B-C一一抗抗二二抗抗链菌素抗生物素链菌素抗生物素蛋白蛋白过氧化过氧化物酶物酶ABCABC法：法：S-PS-P法法：.9(二) 固定、包埋固定液：一般固定液：一般10%10%中性缓冲福尔马林，中性缓冲福尔马林，PH7.3-7.4(PBSPH7.3-7.4(PBS配制配制) )固定时间：应少于固定时间：应少于2424小时，固定时间越长，小时，固定时间越长，抗原丢失越多抗原丢失越多固定液量或组织块大小：组织为固定液量或组织块大小：组织为1/31/3，固定，固定液液2/32/3大体标本：切下一块固定大体标本：切下一块固定.10包埋：包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很起初免疫组化对蜡温的要求很严，

8、温度一高会严重影响结果。现在由于抗严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在6565以下以下.11(三) 抗原修复(抗原暴露、抗原复原)组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性其原

9、因是：其原因是：固定、包埋后部分抗原决定簇与核酸或其它蛋白抗固定、包埋后部分抗原决定簇与核酸或其它蛋白抗原发生了交联，形成网络原发生了交联，形成网络固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原.12抗原修复的目的：就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：只限于需要抗原修复的只限于需要抗原修复的抗体抗体热热微波微波高压锅高压锅水浴锅水浴锅酶消化酶消化胰蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶.13热修复： 0.01M0.01M柠檬酸缓冲

10、液，柠檬酸缓冲液，PH=6.0PH=6.0，9595，1010分钟分钟注意：注意：脱片多脱片多多聚多聚L L赖氨酸赖氨酸 干片干片 选医用微波炉选医用微波炉酶消化：1.1.细胞内抗原细胞内抗原0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶 20203737 2. 2.间质抗原间质抗原4%4%胃蛋白酶胃蛋白酶3737，4-84-8小小时时.14( (八八) )免疫组织化学的发展免疫组织化学的发展1. 1. 免疫免疫PCRPCR：主要用于临床生物分子检测方面：主要用于临床生物分子检测方面 血清血清(Ag)(Ag)电泳电泳+Ab+Ab+无关引物扩增无关引物扩增显色显色 意义：意义：1. 1. 原来较弱、水平较低的

11、酶等，用免疫原来较弱、水平较低的酶等，用免疫PCRPCR就可以检测出来就可以检测出来 2. 2. 需要较长或一定时间才能查出来需要较长或一定时间才能查出来用免疫用免疫PCRPCR法，就可提前查出来法，就可提前查出来如：病毒性心肌炎、血肿如：病毒性心肌炎、血肿CPKCPK检测检测 心梗早期心肌酶谱的检测等心梗早期心肌酶谱的检测等心梗预报：心绞痛心梗预报：心绞痛一般认为没有酶一般认为没有酶 谱改变，设想用免谱改变，设想用免疫疫PCRPCR就可能发现改变就可能发现改变.152. 2. 原位免疫原位免疫PCRPCR在组织切片上有定位在组织切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2Ag+Ab1+Ab2卵白素卵白

12、素洗净洗净生物素标记生物素标记的的DNADNA片断片断洗净洗净原位原位PCRPCR扩增扩增洗净洗净ACBACB或或S-PS-P显色显色 特点：提高阳性率特点：提高阳性率 定位好定位好.162. 2. 扩增扩增：Total: 25lTotal: 25l PCR buffer 2.5l PCR buffer 2.5l mixed dNTP 2.0l mixed dNTP 2.0l dH dH2 2O 16.375lO 16.375l primer 1 1.0l primer 1 1.0l primer 2 1.0l primer 2 1.0l Taq 0.125l Taq 0.125l DNA t

13、emplate 2.0l DNA template 2.0l94 2594 25” 55 25 55 25” 72 40 72 40” 30 30 cyclescycles.173. Agarose 2-5%3. Agarose 2-5%，用，用1 1TBETBE电泳电泳 扩增后液扩增后液 5l + 1l loading buffer5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色溴化乙淀染色 2020，UVUV照射下确认泳带照射下确认泳带照相照相4. DNA4. DNA收集收集 RECOCHIPRECOCHIP法法.18三、三、Western BlottingWestern Blo

14、tting1. 1. 提取蛋白提取蛋白 500l500l的的hypotonic buffer + hypotonic buffer + 组织组织2mm2mm3 3匀浆器匀浆器粉碎粉碎 冰上放置冰上放置3030 1500015000转转/ /分，分，44，3030。上清：细胞质蛋白，上清：细胞质蛋白，+250l 3+250l 3loading loading bufferbuffer沉淀物沉淀物 + 750l + 750l loading buffer loading buffer再次粉碎、离心，上清为细胞膜蛋白再次粉碎、离心，上清为细胞膜蛋白 2-2-氢硫基乙醇氢硫基乙醇 7.5l(1/100

15、)7.5l(1/100)混合混合 9595沸腾沸腾5 5分钟分钟 冰上放置冰上放置.192. 2. 蛋白定量蛋白定量 标准蛋白浓度制备：标准蛋白浓度制备：BSABSA，0 0，0.50.5，1 1，2mg/ml2mg/ml 比色：测定系数比色：测定系数 换算成含量换算成含量 计算出每个样品加样量计算出每个样品加样量3. 3. 电泳电泳 丙烯酰胺丙烯酰胺 上部胶、下部胶上部胶、下部胶 markermarker样品样品4. 4. 转膜转膜5. 5. 洗膜洗膜 一抗、二抗一抗、二抗 显色或自显影显色或自显影.20四、组织芯片四、组织芯片(Tissue Micro-Array, TMA)(Tissue

16、 Micro-Array, TMA) 组织芯片技术是一种特殊生物芯片技术，它是将几组织芯片技术是一种特殊生物芯片技术，它是将几十个或几百个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺十个或几百个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。它使科研人员第一次有可能同时对几百本的分析工具。它使科研人员第一次有可能同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的自然病甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的自然病理生理状态下的组织样本，进行某一个或多个特定的基理生理状态下的组织样本，进行某一个或多个特

17、定的基因，或与其相关的表达产物的研究。因，或与其相关的表达产物的研究。.21应用应用l免疫组化免疫组化lDNADNA或或RNARNA原位杂交原位杂交lFISHFISHl原位原位PCRPCR低密度芯片低密度芯片(50-70(50-70个标本个标本) )、高密度芯片、高密度芯片(500(500个标本个标本) ).22制作过程制作过程1. 1. 组织处理：固定、石蜡包埋、组织处理：固定、石蜡包埋、HEHE染色、组织定位染色、组织定位2. 2. 组织打孔组织打孔/ /阵列仪钻取组织，直径阵列仪钻取组织，直径0.6mm0.6mm3. 3. 制作阵列蜡块，将钻取的组织按设定的位置放入制作阵列蜡块，将钻取的组织按设定的位置放入空白蜡块内空白蜡块内4. 4. 切片厚度为切片厚度为5m