磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺研究

1、磷脂酶 D 催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺研究杨伟东（宝鸡文理学院，陕西宝鸡 721013）摘要：本文研究了磷脂酶 D 催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺，实验结果表明有机相和水相比例、磷脂酰胆碱（PC）浓度、反应温 度、水相 pH 以及反应时间都对磷脂酰丝氨酸的制备有一定的影响。通过正交实验优化利用磷脂酶 D 催化合成磷脂酰丝氨酸的最佳工 艺为：有机相和水相的比例为 4/4、PC 浓度为 75 mg/mL、反应温度为 40 、水相 pH 值为 4.0、反应时间为 12 h，在此工艺条件下 磷脂酰丝氨酸得率为：68.9%。关键词：磷脂酶 D；磷脂酰丝氨酸；制备文章篇号：1673-9078(2010)9-9

2、94-996Synthesis of Phosphatidylserine Catalyzed by Phospholipases DYANG Wei-dong(Baoji University of Sciences and Arts, Baoji 721013, China)Abstract: The synthesis conditions of phosphatidylserine were studied using phospholipases D as biocatalyst. Results showed that the reaction time, the pH of wa

3、ter phase, the phosphatidylcholine concentration, the temperature of reaction and the ratio of organic phase to water phase had influence on the reaction. The orthogonal test showed that the best organic solvent-water ratio, phosphatidylcholine concentration,reaction temperature and time were 4/4, 7

4、5 mg/mL, 70 , and 12 h, respectively, under which the yield of phosphatidylserine amount was68.9%.Key words: phospholipases D; phosphatidylserine; preparation磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称 PS)是一种唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能的磷脂，对许多 细胞代谢过程有重要的调节作用，其主要功能是可提 高脑细胞活力，对治疗脑萎缩、预防老年痴呆症，改 善老年人的大脑功能有很好的疗效1；同时修复大脑 损伤、治疗儿童多动症具有

5、非常显著的作用2；另外 可以促进脑疲劳的恢复、平衡情绪、缓解抑郁也有一 定的疗效34。磷脂酰丝氨酸的制备方法比较多，其中 主要以提取法和酶转化法为主，其中提取法主要是从 植物细胞、动物的卵磷脂中提取 PS，从动物中提取主 要是动物的大脑及内脏56；酶转化法主要是以天然的 卵磷脂为基质，加入丝氨酸，在磷脂酶 D 的作用下， 生成磷脂酰丝氨酸7。近年来，由于疯牛病的等动物 疾病的原因，利用动物细胞提取 PS 的方法，其提取 的产品的安全性收到人们的怀疑，现在已处于淘汰边 缘，而酶法合成条件温和，生产成本低，制备量大是 生产磷脂酰丝氨酸的最理想的方法，本文以大豆磷脂 为原料，研究了不同因素对磷脂酶

6、D 催化合成磷脂酰 丝氨酸的影响，确定了最佳的生产工艺。1 材料和方法1.1 实验材料磷脂酶 D，自制；丙酮、正己烷、乙醇、CaCl2等均为分析纯；大豆磷脂（PC 含量为 50%），市售。1.2 实验方法1.2.1 磷脂酰丝氨酸的制备工艺流程 将一定量的大豆磷脂（PC）溶解于有机溶剂中，然后将酶及丝氨酸溶解到一定量的水相中，分别预热 一段时间后将有机相和水相混合，一定条件下在两相 界面发生反应，反应后通过对有机相的分离提取，得 到磷脂酰丝氨酸。1.2.2 磷脂酰丝氨酸的检测方法（TLC 法）采用 GF254 型硅胶与 5% CMC 溶液按 1:3 (g/mL)的比例制作薄层板，然后采用氯仿:甲

7、醇:水:浓氨水=120:75:6:2 (V/V)展开后，放入碘缸进行染色，用薄层 扫描仪扫描后计算含量。1.2.3 单因素实验 按照磷脂酰丝氨酸的的制备方法，以磷脂酰丝氨酸得率为考察指标，首先在底物(PC) 浓度为 75 mg/mL、水相 pH 值为 4.0、反应温度为 40 、反应收稿日期：2010-05-10994现代食品科技Modern Food Science and Technology2010, Vol.26, No.9时间为 12 h 条件下，考察有机相和水相比例分别为4/1、4/2、4/3、4/4、4/5、4/6 时对 PS 合成的影响，然 后在上一步骤的基础上逐步考查底物浓度

8、（25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL、150 mg/mL、175 mg/mL）、水相 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、反应温度（30 、35 、40 、45 、50 、55 、60 ）和反应时间(116 h)对 PS 合成的影响，每个水平重复 3 次，测定结果取 平均值。1.2.4 正交实验根据单因素实验结果，以 PS 得率为考察指标， 选择有机相和水相的比例、反应温度、底物浓度、反 应时间，设计 5 因素 4 水平正交试验 L16(45)，进行 3次平行试验，结果取其平均值，通过极差分析和实验结果优

9、化磷脂酰丝氨酸的最佳工艺条件。酶 D 的催化能力有限，PS 的合成量基本不再随磷脂酰胆碱的浓度浓度增高而增加，而反应中底物添加量 的增多（PS 的得率等于 PS 的合成量和 PC 的添加量 之比），致使最终 PS 得率随着底物浓度增加反而减小， 所以试验中选用最佳的底物浓度为 75 mg/mL。图 2 PC 浓度对 PS 合成的影响Fig.2 Effect of PC concentration on synthesis of phosphatidylserine2.3水相 pH 对 PS 合成的影响2 结果与讨论2.1有机相和水相的比例对 PS 合成的影响图 3 水相 pH 对 PS 合成的

10、影响Fig.3 Effect of pH of water phase on synthesis of phosphatidylserine由图 3 可看出，在有机相和水相比例 4/4、PC 浓度为 75 mg/mL、反应温度为 40 、反应时间为 12 h 的条件下。当水相 pH 低于 4.0 时，随着水相 pH 的增 加 PS 得率逐渐增加；当水相 pH 高于 4.0 时，逐渐水 相 pH 的增加 PS 得率逐渐减小，所以实验中最佳水相 pH 值为 4.0。图 1 有机相和水相的比例对 PS 合成的影响Fig.1 Effect of organic solvent-water ratio

11、on synthesis of phosphatidylserine由图 1 可以看出，在底物浓度为 75 mg/mL、水相pH 值为 4.0、反应温度为 40 、反应时间为 12 h 条 件下。随着有机相和水相体积比的增加，PS 的生成率 逐渐增加，在体积比小于 4/4 时，PS 的生成率随着体 积比增加而迅速增加，因为随着水相的增加，磷脂酶 D 和底物接触的几率增加，所以 PS 产率增加；当体 积比大于 4/4 时，由于反应体系中底物的量有限，PS 的产率基本保持不变，所以试验中选用有机相和水相 的最佳比例为 4/4。2.2 PC 的浓度对 PS 合成的影响由图 2 可以看出，在有机相和水

12、相比例为 4/4、 水相 pH 值为 4.0、反应温度为 40 、反应时间为 12 h 的情况下，磷脂酰胆碱的浓度低于 75 mg/mL 时，增 加磷脂酰胆碱的浓度 PS 的得率逐渐增加；当磷脂酰 胆碱的浓度高于 75 mg/mL 时，由于反应体系中磷脂2.4反应温度对 PS 合成的影响图 4 反应温度对 PS 合成的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on synthesis of phosphatidylserine995现代食品科技Modern Food Science and Technology2010, Vol.26, No.9由图 4 可

13、看出，在有机相和水相比例为 4/4、PC浓度为 75 mg/mL、水相 pH 值为 4.0、反应时间为为12 h 的情况下。当温度低于 40 时，随着温度的增加 转酰过程形成的过渡态越易形成，从而得率逐渐增加； 当温度高于 40 时，随着温度的增加，酶逐渐失活， 从而使 PS 得率逐渐减小。所以实验中选用 40 为最 佳反应温度。2.5反应时间对 PS 合成的影响由图 5 可以看出，在有机相和水相比例 4/4、PC浓度为 75 mg/mL、水相 pH 值为 4.0 和反应温度为40 的的情况下。在反应初始阶段，随着反应时间的 增加，PS 的得率迅速增加；当反应达到 7 h 时 PS 得 率缓慢

14、增加，到 12 h 是达到最大，随后 PS 的得率反 而随着时间的增加而逐渐降低，这是由于部分生成的 PS 在酶的作用下生成了 PC 等其他物质，所以实验中 选用 12 h 为宜。2.6 正交实验从表 1 可知，5 个因素对磷脂酰丝氨酸制备影响 的主次顺序为 ADBCE，各因素的最优水平组合 为 A2B3C3D3E3，即有机相和水相比例为 4/4、磷脂酰 胆碱的浓度为 75 mg/mL、反应温度为 40 、水相 pH 为 4.0、反应时间为 12 h。对此最优水平进行 3 次验证 试验，测得磷脂酰丝氨酸得率平均为 68.9%。3 结论图 5 反应时间对 PS 合成的影响Fig.5 Effect

15、 of reaction time on synthesis of phosphatidylserine表 1 正交实验结果与分析Table 1 Result and analysis of the orthogonal test通过单因素实验和正交试验确定出利用大豆磷脂生产制备磷脂酰丝氨酸的工艺条件为：有机相和水 相比例为4/4、PC 浓度为75 mg/mL、反应温度为40 、 水相 pH 值为 4.0、反应时间为 12 h，在该工艺条件下 磷脂酰丝氨酸得率为 68.9%。A (有机相与水相比)B 底物浓度/ C (反应温D(pH)E (反应时间/h)得率/%序号度/)(mg/mL)1234

16、5678910111213141516K1K2K3K4Rj1 (4:3)1112 (4:4)2223 (4:5)3334 (4:6)44453.45059.20056.70049.10010.1001 (25)2 (50)3 (75)4 (100)12341234123453.82556.45057.40050.7756.6251 (30)2 (35)3 (40)4 (45)34124321214351.37555.35056.75054.9755.3751 (3.0)2 (3.5)3 (4.0)4 (4.5)34124321214352.35052.67559.87553.5507.5251

17、 (10)2 (11)3 (12)4 (13)43212143341252.65052.42557.37556.0004.95045.251.966.450.365.859.557.953.654.862.255.754.149.552.249.645.1参考文献1Parris M Kidd. Phosphatidylserine; Membrane Nutrient forMemory. A Clinical and Mechanistic Assessment J. Alternative Medicine Review.1996;I(2):70-84MeDaniel M A, Maier S F, Einstein G O. Brain-specific nutrients: A memory cure? J. Nutrition, 2003, 19(11/12):957-975诺亚,PS 磷脂酰丝氨酸运动营养品的功用J. 科学训 练,2004,02:28-30Tlffano G, Bruni A. Pharmacological proprties