最牛!最全面的单克隆抗体制备技术

1、单克隆抗体制备技术 一、实验原理B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种 B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的 B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的 B细胞融合。采用

2、HAT选择性培养基（hypoxanthine-aminopterin-thymidine次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成 DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成 DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成 DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。 单克隆抗体与常规抗体相比

3、有如下优点：单一特异性，与一个抗原决定簇反应；可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；一经制出，可无限量地供应；生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。二、实验材料1。主要仪器CO2培养箱、台式离心机、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、酶标仪、电热恒温水浴箱、超纯水系统、超净工作台、核酸电泳仪、SDS-PAGE电泳仪、Western Blotting转膜仪、凝胶成像系统等。2主要试剂HAT培养基（购自Sigma公司）、HT培养基（购自Sigma公司）、RPMI1640培养基（购自GIBCO公司）、羊抗鼠IgG-HRP抗体（购自Sigma公司）、羊抗鼠IgG-

4、FITC抗体（购自Sigma公司）、胎牛血清（购自GIBCO公司）、DMSO（购自Sigma公司）、50%PEG（购自Sigma公司）、DMEM培养基（购自GIBCO公司）等。3。实验动物 6-8周龄Babl/c小鼠，SPF级，购自湖北省疾病预防和控制中心或武汉大学中南医院实验动物中心。三、操作程序以下为单克隆抗体制备的操作过程，值得注意的地方用小字体标出1、动物免疫首先，取适量抗原(约100ug)与等体积的佛氏完全佐剂乳化，免疫动物为4-6周龄的雌性BALB/c鼠。免疫方案及程序为:背部皮下注射佛氏完全佐剂乳化的抗原100ug/只;2周后换用不完全佐剂乳化等量抗原，背部皮下注射;间隔至少1个

5、月后，三免,200ug/只;在融合前三天通过脾内、尾静脉注射进行加强免疫，抗原量为200-300ug/只（一般为100ug，如果抗原量过大的话，小鼠可能会发生应激死亡），不加佐剂。2、SP2/0骨髓瘤细胞的活化 骨髓瘤细胞的复苏: 从液氮罐中取出骨髓瘤细胞冻存管,放入37水浴锅中至完全融化;1000r/min离心3-5min;倒弃上清液,用营养液(RPMI-1640,小牛血清的浓度在10%-20%)将下沉的细胞吹散悬浮后加入有适量营养液的细胞培养瓶中,置5%CO2 37培养箱培养;次日观察骨髓瘤细胞的生长情况,如为圆形,透亮,呈轻微贴壁生长,则说明骨髓瘤细胞生长良好,如发现有些细胞发暗,漂浮于

6、液体中,则可以换液,弃去漂浮的死亡细胞,此时存活的细胞大部分可贴壁生长并增殖.培养3-5d后进行细胞传代,扩大培养.将细胞板中培养的SP2/0细胞，收集起来用0.5ml1640基础液悬浮.(0.51*106个)注射BALB/c小鼠背部皮下。待910d瘤子生长后，视大小选择取瘤细胞的时间。3、细胞融合一般在免疫小鼠加强免疫后35天做细胞融合结果比较好。在融合之前应将PEG、40ml终止液（基础1640）和HAT培养基放入37温箱预热备用。三种细胞的制备方法如下，结合以往做的经验，一般分离的顺序为：首先制备SP2/0瘤细胞，然后制备饲养细胞，最后制备免疫脾细胞。3.1 SP2/0瘤细胞的制备从小鼠

7、背部生长的瘤子中制备的方法如下:1小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5min,超净台无菌状态取瘤；2先将肿瘤块剪下，放于匀浆器中，加5ml1640基础液充分研磨后，补加10ml1640液，静置2min，待较大的组织团块沉于管底后，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加10ml1640液，重复两次（在重悬的过程中，第一次应只吸出5ml，因为第一次匀浆器里面的细胞和大的组织块比较多，细胞下沉的速度比较）；31000r/min离心10min去上清，以基础1640液重悬细胞，将细胞悬液体积控制在30ml；4于另一50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液，将细胞悬液轻轻地加在分离液之上(比例为1:2到1

8、:1)；51200r/rnin 15min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，（吸管应该放在50ml离心管的中部去吸取，在离心管的内壁上有少许的组织和杂质，如果吸出的话，会影响瘤细胞的纯度）用1640液洗2遍，然后用10ml 1640重悬细胞，计数后备用。3.2免疫脾细胞的制备1取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5-10min消毒;2将消毒好的老鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织，剪破脾脏

9、外膜（可以将脾脏少许剪几下，便于脾细胞的分离），放入灭菌的匀浆器中;3加5ml1640基础液于匀浆器中，研磨(不要太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加10ml1640基础液，静置2min，吸取上层细胞悬液于另一无菌的50ml离心管，再补加10ml1640液于匀浆器中，同上重复2次（在重悬的过程中，第一次应只吸出5ml，因为第一次匀浆器里面的细胞和大的组织块比较多，细胞下沉的速度比较）;41000r/min离心10min去上清，细胞重悬后计数.3.3饲养细胞的制备1取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。2四肢固定后，先撕开皮，露出腹

10、膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管23ml（视老鼠大小而定）1640基础液注入小鼠腹腔，吸打几次，再将液体吸出放于一50ml离心管，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。3同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。41000r/min离心10min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37，5%C02培养箱中待用。3.4 细胞融合1将1-2x107个SP2/0与108个免疫细胞(1:10-1:15)于50ml离心管中混匀，1000r/min，离心8min。2倒空上清(用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动(便于PEG充分的作用细胞)。3将装有细胞混合物的离心管放于37水

11、浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37的50%PEG 0.8ml(sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。4继续搅拌30s，静置30s。5然后慢慢加入37预温的1640基础液10ml。具体方法为:第一分钟逐滴滴入1ml。第二分钟加lml，（前两毫升一定要在一分钟内缓慢的加入，并且要不断的搅动，切忌加入速度过快）第34分钟加3ml，第5分钟加其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30ml1640液，也需慢慢加入。61000r/min离心5min，去上清于37放置5-8min。7用悬浮饲养脾细胞的HAT培养基与融合后的细胞混合（在用含有饲养细胞的HAT培养基重悬融合离心以后的

12、细胞时，可以多吹吸几次，但是力度一定要小，因为刚刚融合到一起的细胞如果力度过大的话有可能会把它再次吹散），根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250ul/孔。一次融合可接种4-8块96孔板。(根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞)8于37，5%CO2培养箱中培养。9融合后第二天开始观察，有无污染，第4天吸去100ul培养基换HT培养基100ul（或者吸去80ul培养基补加一滴。另外，不论是用移液器还是用吸管在补加HT培养基时，力度一定要小，一定要防止将细胞集落打散，打散的话，集落就很容易死亡）。待融合细胞集落长至培养孔1/

13、4，培养基略变黄时，进行抗体检测（另外，在抗体检测之前这几天的观察过程中，如果发现集落的生长状态不好的话，一定要及时采取不久措施）。4、间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下(整个过程中应该注意的是：每一次加样，不论是细胞上清、二抗以及洗涤液最好是悬空加，避免交叉污染)：1包被已知抗原:用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10ug/ml（一般为15ug，具体的蛋白包被量应该按照方针滴定的结果来确定）;向微孔中每孔加100ul,轻轻摇匀,4冰箱过夜或37 1h;甩掉孔内液体（尽量拍干空里面的液体），洗涤3次。每次23分钟。2封闭酶标孔中没被抗原包被

14、的位置:向微孔中每孔加200ul封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA）,轻轻摇匀, 37 1h;甩掉孔内液体;逐孔加满洗涤缓冲液（200ul,视现实情况而定。实验室现有黄色枪头只能吸这么多，再多的话会将洗涤液吸到移液器里，污染移液器）,静置23min,甩掉孔内液体,拍干,用此法先用洗涤缓冲液洗3次。3加样:将待测的杂交瘤每孔取50ul上清液按顺序加入酶标孔中,轻轻摇匀.37 1h,洗涤,拍干。4加酶标抗抗体:先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度,每孔加入100ul,轻轻摇匀,置37 1h;然后洗涤,拍干。5加显色液:每孔加新鲜配置的显色液100ul,轻轻摇匀,37, 10m

15、in.6终止反应:每孔加终止液50ul.7判定结果:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果,根据颜色深浅,判定.也可在酶标仪上测定OD630nm值.5、杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)1克隆前制备小鼠饲养细胞层（根据经验，克隆的时候可以先制备好饲养细胞，值得注意的是制备好以后不要立即就将饲养细胞分装到96孔板里，如果先将饲养细胞铺到板子里的话，再加稀释好的杂交瘤细胞时，就将饲养细胞吹到了细胞板孔的周围，而中间的饲养细胞就很少，但是有时候杂交瘤细胞就是在细胞板孔的中间，这样的话，就不利于杂交瘤细胞的生长，因为，可以先制备好饲养细胞，放在一边，等克隆全部完成以后再将饲养细胞分铺到细胞板孔里，这样的效果

16、会好很多）。2将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数。3将细胞用完全培养基稀释到5、10、50个细胞/毫升。4将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的%孔培养板，100ul/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞。5培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。6特异性抗体的检测:在克隆后第79天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测。（如检出细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续同法再克隆或扩大培养，直到该杂交瘤细胞株很纯后就可扩大培养）。7阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待

17、24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水，并冻存4支以上的细胞。6、单克隆抗体的生产和效价测定建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液，用间接ELISA测定效价。也可在小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体，取8-10周龄的小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡（或者弗氏不完全佐剂）0.5ml/只，7-10天后腹腔注射杂交瘤细胞5x105-106/只（一个24孔细胞板的细胞长满后，收集细胞注射即可），7-10天后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存细胞。7、间接ELISA法检测腹水中抗体滴度 具体实验步骤参照第四步，只是在加样时，也就是在加腹水时，要做倍比稀释，一般从1：100开始，做16个稀

18、释度即可（建议在一块ELISA板子上做完这16个稀释度），并以SP2/0腹水作为对照来进行结果判定。8、间接免疫荧光法检测单克隆抗体1。将MARC-145细胞培养于24孔培养板，待细胞长成单层后，接种PRRSV，同时设不接毒的正常细胞对照，待细胞出现轻微病变后用80%丙酮（-20预冷30min）固定10min，然后用PBS洗涤三次，每次5min；2。加入待检的单抗样品(杂交瘤培养上清用原液，腹水1:100稀释)，同时做阳性(纯化PRRSV高免小鼠血清1:50稀释)和阴性(未免疫空白小鼠血清1:50稀释、SP2/0细胞培养上清原液、SP2/O细胞制备的腹水1:100稀释)对照。37温育30min，PBS洗三次；3。加入异硫氰酸荧光素(Fluorescein isocyanate,FITC)标记的羊抗鼠IgG(sigma 1:100)，37温育30min，PBS洗三次，在荧光显微镜下观察。如空白和已知的阴、阳性对照孔的结果均成立时，记录各个单抗的检测结果。另外还可以做真核验证：1。将Hela细胞培养于24孔培养板带细胞长到60%80%时，转染构建的真核表达质粒（例如：PCAGGS-HA-Nsp7）,同时转染空载体（PCAGGS-HA）作为对照，48H后，用80%丙酮（-20预冷30min）固定10min，然后用PBS洗涤三次，每次5min；第2、3步同上。