第章高效液相色谱法分析化学

1、概述概述 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)(HPLC)是以是以溶剂液体为流动相溶剂液体为流动相的色谱方法。的色谱方法。 早期液相色谱，包括早期液相色谱，包括TswettTswett的工作，都是在直径的工作，都是在直径15cm15cm, , 长长50500cm50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在固定相颗粒直径多在150200150200 m m范围内。即使这样，流速仍然范围内。即使这样，流速仍然很低很低(1mL/min)(BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系1 1分离机

2、制分离机制 离子对模型离子对模型非极性或弱极性3 3用途用途 适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。化合物的混合物的分离。可以避免用普通的可以避免用普通的HPLCHPLC仪器长期进行仪器长期进行IECIEC时，时，流动相（酸、碱）对泵与流路的腐蚀。流动相（酸、碱）对泵与流路的腐蚀。此法在药物分析中应用很广此法在药物分析中应用很广 （四）离子抑制色谱法（四）离子抑制色谱法 在反相色谱法中，通过调节流动相的在反相色谱法中，通过调节流动相的pHpH值，值，抑制样品组分的

3、解离，增加它在固定相中的抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（称为离子抑制色谱法（ISCISC）。）。 （一）离子色谱法（一）离子色谱法 离子色谱离子色谱( (ICIC) )是是7070年代发展的新方法。其分年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高电解质，其电导率比待测离子约高2 2个数量级，这个数量级，这种强背景电导

4、会完全掩盖待测离子信号。种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。 为解决此问题，为解决此问题，19751975年年SmallSmall提出，在离子交提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。测器检测各种离子的含量。该法可以分析无机与有机阴、阳离子和氨基该法可以分析无机与有

5、机阴、阳离子和氨基酸，以及糖类和酸，以及糖类和DNADNA、RNARNA的水解产物等。的水解产物等。该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液此有人提出了使用电导率很低的溶液( (如苯甲如苯甲酸盐稀溶液酸盐稀溶液) )作流动相。作流动相。 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸

6、附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。2211-4nkkR 3 3 传质阻抗传质阻抗 由三个系数组成： C Cs CmCsm Cs固定相传质阻抗 Cm流动相传质阻抗 Csm静态流动相传质阻抗 sfssD

7、dC2（1）固定相传质阻抗mpmmDdC2m m是由柱和填充的性质决定的因子是由柱和填充的性质决定的因子mpsmsmDdC2 smsm与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。数及容量因子有关。采用ODS柱为固定相，甲醇-水为流动相，用HPLC来分离两种弱碱性药物（pKa=89）,但分离效果不理想：主要表现为柱效能低，保留时间过短。试设计通过改变流动相来提高分离效能的方案。(10分)流程流程进样器馏分收集器记录仪检测器分离和进样系统分离和进样系统 （一）进样系统（一）进样系统 与与GCGC相比，相比，HPLCHPLC柱要短得多，因此由于柱柱要短得多，

8、因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLCHPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。体积。进样装置包括两种。 1. 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。差。2. 2. 高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，于进样量可由样品管控制

9、，因此进样准确，重复性好，如图。重复性好，如图。（二）（二） 色谱柱色谱柱由柱管与固定相组成，柱管多用不锈钢制成，由柱管与固定相组成，柱管多用不锈钢制成，管内壁要求具有很高的光洁度。固定相采用匀管内壁要求具有很高的光洁度。固定相采用匀浆法高压（浆法高压（80 80 100MPa100MPa）装柱。）装柱。色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类分析型柱分析型柱 常量柱：内径常量柱：内径2 24.6mm4.6mm，柱长，柱长1010 25cm25cm。半微量柱：内径半微量柱：内径1 1 1.5mm1.5mm，柱长，柱长1010 20cm20cm实验室制备型柱：

10、内径实验室制备型柱：内径2020 40mm40mm，柱长，柱长101030cm30cm 常用色谱柱柱效评价条件如下：常用色谱柱柱效评价条件如下：硅胶柱硅胶柱 样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）；样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）；流动相：无水己烷。流动相：无水己烷。反相色谱柱反相色谱柱（ODSODS柱等）样品：尿嘧啶（测死时间用）、硝柱等）样品：尿嘧啶（测死时间用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）；基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）；流动相：甲醇流动相：甲醇水（水（8585：1515） 乙腈乙腈水（水（6060：4O4O）。）。正相色谱柱（氰基与氨基柱等）正相色谱柱（氰基与氨

11、基柱等）样品： 四氯乙烯（测死时间用）、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇。也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯为样品；流动相：正庚烷 按上述条件，测得各组分的W1/2。及tR，求出理论塔板数n及相邻组分的分离度R（l5）。 色谱柱柱效指标色谱柱柱效指标 填料粒径为填料粒径为3m3m、4m4m、5m 5m 、7m7m或或10m10m时，柱效应分别大于时，柱效应分别大于8 8万、万、6 6万、万、5 5万、万、4 4万及万及 2 25 5万理论塔板数米（或用万理论塔板数米（或用 m m1 1表示表示）。）。 色谱柱的再生色谱柱的再生 反相色谱柱反相色谱柱 以甲醇一水（以甲醇一水（9595：

12、5 5）、纯）、纯甲醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺甲醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。每种流动相的冲洗体积应序不得颠倒。每种流动相的冲洗体积应2020倍倍于柱体积。然后，再以相反顺序依次冲洗。于柱体积。然后，再以相反顺序依次冲洗。 正相色谱柱（含硅胶柱）正相色谱柱（含硅胶柱）以严格脱水的以严格脱水的正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。其它步骤同上，依次冲洗，顺序不得颠倒。其它步骤同上。 三、检测系统三、检测系统 要求：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、要求：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重复性好、适用性广等。重复

13、性好、适用性广等。 应用最多的是紫外检测器（应用最多的是紫外检测器（UVDUVD）。其）。其次是荧光检测器（次是荧光检测器（FDFD）与电化学检测器（）与电化学检测器（ECDECD）。示差折光检测器（）。示差折光检测器（RIDRID）虽是泛用型）虽是泛用型检测器，因受温度影响较大，灵敏度不够高检测器，因受温度影响较大，灵敏度不够高，除还用于糖类的检测外，已少用。，除还用于糖类的检测外，已少用。 新型蒸发光散射检测器及发光检测器是新型蒸发光散射检测器及发光检测器是有发展前途的检测器。有发展前途的检测器。（一）紫外检测器（一）紫外检测器（UVDUVD或或UVUV）HPLCHPLC分析中因此该类检测

14、器应用很广。分析中因此该类检测器应用很广。原理原理 样品组分通过流通池时对特定波长紫样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收与浓度成正比。外线的吸收与浓度成正比。检测系统检测系统 由光源、流通池、检测元件、由光源、流通池、检测元件、微机及记录器等组成。微机及记录器等组成。 常用纯溶剂的截止波长：水常用纯溶剂的截止波长：水190190、乙腈、乙腈190190、甲醇、甲醇205205、正己烷、正己烷210210、乙醚、乙醚220220、四氢、四氢呋喃呋喃225225、二氯甲烷、二氯甲烷245245、氯仿、氯仿245nm245nm。 在选择测量波长时注意在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所：溶剂必

15、须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长（最低使用波长（截止波长截止波长）。特点特点 灵敏度高灵敏度高, ,噪音低，最小检出量可达噪音低，最小检出量可达1010-12-12g g 不破坏样品，能与其它检测器串联。不破坏样品，能与其它检测器串联。 对温度及流速波动不敏感，可用于梯度淋对温度及流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。洗。 属浓度型检测器。属浓度型检测器。弱点弱点 只能检测有紫外吸收的样品；只能检测有紫外吸收的样品； 流动相的选择有一定限制。流动相的选择有一定限制。紫外吸收检测器的类型紫外吸收检测器的类型 分为：固定波长型、可变波长型及

16、二分为：固定波长型、可变波长型及二极管阵列检测器三种。极管阵列检测器三种。1.1.固定波长检测器固定波长检测器 是光源波长固定的光度计，一般波是光源波长固定的光度计，一般波长为长为254nm254nm，相当于定波长紫外光度计。，相当于定波长紫外光度计。因波长不能调节，不能选择在最佳吸收波因波长不能调节，不能选择在最佳吸收波长下检测，长下检测，已基本淘汰已基本淘汰。 2 2可变波长型检测器可变波长型检测器 是一台紫外是一台紫外可见分光光度计或紫外分可见分光光度计或紫外分光光度计，波长可按需要选择。是光光度计，波长可按需要选择。是HPLCHPLC配置最配置最多的检测器。其光学结构与一般紫外分光光度

17、多的检测器。其光学结构与一般紫外分光光度计一致，主要区别是用流通池替代了比色池。计一致，主要区别是用流通池替代了比色池。通常其光程为通常其光程为2 210mm, 10mm, 体积约为体积约为1 110 10 L L。 3.3.光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（PDADPDAD） 是是8080年代出现的新型紫外检测器。人们想年代出现的新型紫外检测器。人们想测定通过流通池时各组分的光谱获得定性信息。测定通过流通池时各组分的光谱获得定性信息。但因组分停留时间太短但因组分停留时间太短( (1 1秒秒) )，普通紫外分，普通紫外分光光度计的扫描速度跟不上，若停留扫描则破光光度计的扫描速度跟不上

18、，若停留扫描则破坏了分离状态。而二极管阵列检测器用坏了分离状态。而二极管阵列检测器用二极管二极管阵列代替光电管阵列代替光电管，一般一个二极管对应接受光，一般一个二极管对应接受光谱上一个纳米（谱上一个纳米（nmnm）谱带宽度的单色光。可在）谱带宽度的单色光。可在全波长范围进行快速扫描，全波长范围进行快速扫描，获得三维光谱一色获得三维光谱一色谱图，同时得到定性、定量信息。谱图，同时得到定性、定量信息。（二）荧光检测器（二）荧光检测器（FDFD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光光度计，已基本淘汰。光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池目前使用的

19、荧光检测器多是具有流通池的荧光分光光度计（直角光路）。的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达检测限可达1 1 10 10-10-10g gmlml，比紫外检，比紫外检测器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生测器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。物能发荧光的物质。 （三）蒸发光散射、化学发光及安培检测器（三）蒸发光散射、化学发光及安培检测器 1 1蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSDELSD） 是90年代出现的最新型的泛用检测器。可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等。还可用于凝胶色谱及超临界流体色谱的检测。 原理

20、：原理： 将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气（高纯N2）的蒸发室，加热，使流动相蒸发除去。组分则形成气溶胶，被载气带入检测室，用激光或强光照射气溶胶而产生散射光（丁锋尔光效应），测定散射光强而获得组分的浓度信号。散射光强I与进入检测器的气溶胶中组分质点的“质量和”m的关系为： Ikmb k、b是二个与实验条件有关的常数2 2化学发光检测器化学发光检测器 是近年发展起来的高选择性、高灵敏度是近年发展起来的高选择性、高灵敏度的新型检测器。设备简单，自身发光不需光的新型检测器。设备简单，自身发光不需光源，价格便宜，可自制，很有发展前途。化源，价格便宜，可自制，很有发展前途。化学发光反应常用酶为催

21、化剂，将酶标记在待学发光反应常用酶为催化剂，将酶标记在待测物、抗原或抗体上，可进行药物代谢分析测物、抗原或抗体上，可进行药物代谢分析及免疫发光分析。及免疫发光分析。 检测原理检测原理 某些物质在常温下与发光试剂反应，生成某些物质在常温下与发光试剂反应，生成处于激发态的产物，当它们由激发态返回基态处于激发态的产物，当它们由激发态返回基态时发射光子。因其能量来源于化学反应，故称时发射光子。因其能量来源于化学反应，故称为化学发光。光强与组分浓度成正比。最小检为化学发光。光强与组分浓度成正比。最小检测量可达测量可达pgpg级（级（10101212g g）。）。3 3安培检测器（安培检测器（ADAD）

22、电化学检测器包括电化学检测器包括电导检测器、安培检电导检测器、安培检测器及极谱检测器等。电导检测器主要用于测器及极谱检测器等。电导检测器主要用于离子色谱，安培检测器与极谱检测器可用于离子色谱，安培检测器与极谱检测器可用于可氧化、还原的物质的检测。可氧化、还原的物质的检测。 其它其它 尚有红外检测器、介电常数检测器及尚有红外检测器、介电常数检测器及放射性检测器等。放射性检测器等。 接参比电极接参比电极和对电极和对电极接色谱柱接色谱柱Teflon塑料块塑料块1 cm工作电极工作电极(Pt, Au, 碳糊碳糊)第四节第四节 高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法一、定性分析方法一、定性分析方法 H

23、PLCHPLC的定性方法与的定性方法与GCGC相似，可分为色谱相似，可分为色谱鉴定法及非色谱鉴定法两类。鉴定法及非色谱鉴定法两类。 1 1色谱鉴定法色谱鉴定法 保留时间或相对保留时保留时间或相对保留时间对照。间对照。 2 2化学鉴定法化学鉴定法 分离后收集组分定性。分离后收集组分定性。 3 3两谱联用鉴定法两谱联用鉴定法 （1 1）两谱联用法：）两谱联用法：用用 HPLCHPLC制备纯组分，制备纯组分，用光谱仪器鉴定。用光谱仪器鉴定。 （2 2）两谱联用仪：）两谱联用仪：能同时获得定性、定能同时获得定性、定量信息。如量信息。如HPLCHPLCUVUV、HPLCHPLCFTIRFTIR及及 HPLCHPLCMSMS等。等。 二、定量分析方法二、定量分