人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定

1、人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定         08-03-01 16:46:00     编辑：studa20                  作者：刘晓丹，刘兵，李秀森，毛宁【摘要】  本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在间充质干细胞及其分离和扩增方法。从正常产妇分娩后的脐带静脉

2、灌注液分离间充质干细胞，观察细胞形态并用流式细胞仪分析其细胞表型和细胞周期，在体外分别诱导其成骨、成脂肪和成软骨细胞分化。结果表明：脐带静脉灌注液来源的间充质干细胞为成纤维细胞样，高表达CD29、HLAABC、CD166、CD105、CD73、CD44；不表达造血和内皮标志（CD34、CD45、CD144和CD14）。它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化，符合间充质干细胞的基本功能特征。结论：人脐带静脉灌注液存在间充质干细胞，能够在体外培养和扩增，可作为今后细胞治疗和组织工程的种子细胞。 【关键词】  脐带静脉灌注液     Isolation an

3、d Identification of Mesenchymal Stem Cells from Perfusion of Human Umbilical  Cord Vein      Abstract    This study was aimed to investigate whether mesenchymal stem cells (MSCs) existed in human umbilical cord vein and to establish the methods of isolati

4、on and expansion in vitro. The MSCs direved for perfusion of umbilical cord vein (UVMSCs) were collected after parturition of Healthy pregnant women. The morphology of MSCs and their differentiation potential into osteoblast, adipocyte and chondrocyte were observed the phenotype and cell cycle of MS

5、Cs were determined by using flow cytometry. The result showed that the mesenchymal stem cells separated from umbilical cord  vein gave rise to a population of adherent cells with a typical fibroblastlike morphology. Similarly to bone marrowderived MSCs,  they highly expressed CD29, HLAABC,

6、 CD166, CD105, CD73 and CD44, and were negative for any hematopoietic and endothelial markers (CD45, CD34, CD14 and CD144). Functionally, they could differentiate into the osteoblast, adipocyte and chondrocyte. It is concluded that  MSCs exist in the human umbilical cord vein perfusion.  T

7、heir read amplification in vitro contribute to  clinical applications for cell therapy and tissue engineering.    Key words    mesenchymal stem cell; umbilical  cord vein perfusion; cell  isolation; cell identification    间充质干细胞（mensenchyma

8、l stem cells,  MSC）最早自骨髓中分离，是一类具有自我更新及多向分化潜能的  中胚层源干细胞1。作为多种骨髓基质的前体细胞，MSC能通过调节造血微环境以促进造血干细胞增殖、分化，它亦能调节淋巴细胞免疫功能，从而减轻移植排斥反应等生物学效应2。MSC的发现为针对性解决造血干细胞移植，尤其是脐血移植中的干细胞数量相对不足及减轻移植物抗宿主病提供了一个有效手段3，4。然而，临床上骨髓取材困难，供体有限，随年龄的增加其增殖和分化能力下降，且有病毒污染的可能5 。因此，寻找MSC的新来源具有重要意义。本研究从易于获取、且组织来源较为原始的脐带静脉灌注液中寻找MSC（U

9、VMSC），并对其进行生物学特性的鉴定。    材料和方法    材料与试剂    脐带来自北京市中西医结合医院正常分娩产妇，均经父母授权同意。胶原酶为Sigma公司产品，DMEM为Hyclone公司产品，胎牛血清为FBS，Stem Cell产品，L谷氨酰胺为Amresco公司产品，EGF为Peprotech公司产品，rhVEGF为R&D公司产品，bFGF为双鹭药业公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，诱导试剂：地塞米松、甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐、3异丁酸1甲基黄嘌呤（IBMX），胰岛素、

10、消炎痛、丙酮酸钠均为Sigma公司产品，TGF3为R&D公司产品，ITSA为Sigma公司产品；流式相关鼠抗人单克隆抗体：CD29PE、CD166PE、 CD14、CD144PE、CD34FITC、CD45FITC、HLAABCFITC、HLADRFITC、CD44FITC、CD105FITC均为Becton Dickinson公司产品），碱性磷酸酶检测试剂盒为Sigma公司产品。    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定UVMSC的分离培养与传代  

11、;  取正常产妇分娩后的脐带静脉，无菌条件下用PBS清洗脐带静脉外表面及脐带静脉，止血钳夹住一端，根据脐带静脉的长度，加入适量的0.1% 型胶原酶，37孵育30分钟，弃去脐带静脉内液体，用PBS灌注脐带静脉3次，收集灌注液，按1×105/cm2,接种于25 cm2的塑料培养瓶中，培养体系为： 10% FBS、MEM、EGF（10 ng/ml）、rhVEGF（10 ng/ml），青霉素（100 U/ml ）、链霉素（100 U/ml ）、L谷氨酰胺2 mmol/L，置于37和5% CO2条件下孵育72小时后换新鲜培养液，待细胞融合达80%以上，加入0.05%胰蛋白酶EDTA溶

12、液消化，按13或14传代。待3代后，细胞形态呈纤维细胞状，可停止加入EGF和VEGF。取3代以上细胞作后续试验。    UVMSC 表面抗原的检测    取第5代处于对数生长期UVMSC，按每管2×105个细胞，依次加入10 l鼠抗人单克隆抗体CD29PE、CD166PE、CD73PE、CD14PE、CD144PE、CD34FITC、CD45FITC、HLAABC、HLADR、CD44FITC、CD105FITC，另设1管为对照组，室温避光30分钟；用PBS反复洗2-3次，减少非特异性结合；离心后，加入1%多聚甲醛固定，4保

13、存，1周以内进行流式细胞仪检测。    UVMSC的细胞周期检测    收集对数生长期UVMSC 1×106，PBS洗2次，0.9% FBS的70%乙醇重悬，4保存过夜，然后用PBS洗2次，加1 mg/ml RNase于37孵育30分钟，加入150 g/ml PI,室温避光20分钟，上流式细胞仪进行细胞周期检测。    UVMSC的生长曲线检测    收集UVMSC细胞，按每孔500个细胞接种于96孔板内，每组3个复孔，待24小时后，加入MTT 20 l，4小时后加

14、入100 l裂解液，于37过夜，第2天用酶联仪测定OD540，连续测定6天。    定向诱导UVMSC向成骨细胞分化的方法与鉴定    收集消化后UVMSC，按3 000/cm2接种于6孔板内，成骨的诱导体系为：地塞米松0.1  mol/L、甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 mol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量换液，维持3周，然后进行碱性磷酸酶检测，方法同文献6。    定向诱导UVMSC向脂肪细胞分化的方法与鉴定    收集UVMSC后按9 000/cm2接种于6孔板内，待细胞贴壁后，加入脂肪诱导体系:地塞米松1 mol/L、IBMX 0.5 mol/L、消炎痛200 mol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量换液，维持3周，然后进行油红染色，显微镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。    定向诱导UVMSC向