基因的功能验证-陈璟

1、基因的功能验证基因的功能验证 陈璟陈璟 2012.09.252020世纪人类科技史上的三大创举世纪人类科技史上的三大创举40年代第一颗原子弹爆炸60年代人类首次登上月球90年代人类基因组计划基因组学包括3个不同的亚领域结构基因组学(structural genomics) 功能基因组学(functional genomics)比较基因组学(comparative genomics) 基因组学概念 一是通过一是通过增强其表达增强其表达，取得表达产物进行研究，取得表达产物进行研究， 增强其表达增强其表达因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃抛弃

2、 基因的异源表达，在近缘物种类表达目的基因。基因的异源表达，在近缘物种类表达目的基因。 二是二是减弱减弱或者或者终止其表达终止其表达，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因功功能能DNA-Binding DomainBait ProteinPrey ProteinTranscription Activating RegionReporter GeneDNA-Binding Site酵母双杂交技术反式作用因子中的两个功能结构域反式作用因子中的两个功能结构域 DNA结合域结合域 转录激活结构域转录激活结构域鉴定新的蛋白与蛋白相互作用鉴定蛋白级联底物 鉴定突变

3、对蛋白与蛋白结合的影响在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 (反向双杂交系统)酵母双杂交系统应用酵母双杂交系统应用利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型 第一相电泳根据蛋白质的不同等电点分离各种蛋白质，即等电第一相电泳根据蛋白质的不同等电点分离各种蛋白质，即等电聚焦法聚焦法(isoelectrie focusing IEF) 第二向电泳根据蛋白质的不同分子量进一步分离等电点相同的第二向电泳根据蛋白质的不同分子量进一步分离等电点相同的蛋白质，即蛋白质，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要

4、技术之一, 双向电泳双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质再再PAGE上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题。是双向电泳分析软件所要解决的问题。差异点：差异点：蛋白质的分离与鉴定 蛋白质经双向电泳分离及图像分

5、析后，将蛋白质斑点胶块切下，用蛋白酶通常用胰蛋白酶)对蛋白质样品进行胶内酶解，获得肽片段 上质谱分析蛋白质成分质谱基础质谱基础样品样品离子源离子源质量分析器质量分析器离子检测器离子检测器固体固体液体液体蒸汽蒸汽形成离子形成离子(带电分子带电分子)电离电离质量分选质量分选(过滤过滤)检测检测根据根据m/z分选离子分选离子数据处理数据处理质谱质谱检测离子检测离子基本步骤基本步骤:1. 样品离子化样品离子化 2. 根据质量根据质量(m/z)不同分离离子不同分离离子3. 检测每种质量离子的数目检测每种质量离子的数目 4. 收集、处理数据得到质谱图收集、处理数据得到质谱图 组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（傅里叶转换回旋共振质谱（