第十二章病毒的分子生物学

1、第十二章第十二章 病毒的分子生物学病毒的分子生物学 12.1 病毒分子生物学研究的内容病毒分子生物学研究的内容 病毒分子生物学是用现代分子生物学的病毒分子生物学是用现代分子生物学的新理论、新技术和新方法对病毒基因组新理论、新技术和新方法对病毒基因组的结构与功能，基因组的复制、表达和的结构与功能，基因组的复制、表达和调控，病毒与宿主的相互作用关系等进调控，病毒与宿主的相互作用关系等进行研究的一门学科。行研究的一门学科。 人类对病毒的研究成果在现代分子生物人类对病毒的研究成果在现代分子生物学的发展史上，做出了重大的贡献。许学的发展史上，做出了重大的贡献。许多分子生物学上的重大突破都是以病毒多分子生

2、物学上的重大突破都是以病毒作为模式或研究材料而进行的。作为模式或研究材料而进行的。 其研究成果除了揭示许多重要的分子生其研究成果除了揭示许多重要的分子生物学过程之外，对人类认识病毒感染、物学过程之外，对人类认识病毒感染、致病的分子本质，为病毒引起疾病的诊致病的分子本质，为病毒引起疾病的诊断、预防和治疗提供了理论基础，促进断、预防和治疗提供了理论基础，促进了基因工程疫苗和抗病毒药物的研制和了基因工程疫苗和抗病毒药物的研制和发展。发展。 病毒分子生物学研究领域病毒分子生物学研究领域12.1.1 12.1.1 病毒基因组的结构病毒基因组的结构12.1.2 12.1.2 病毒基因组的复制和表达调控病毒

3、基因组的复制和表达调控12.1.3 12.1.3 病毒对宿主细胞的影响病毒对宿主细胞的影响12.1.4 12.1.4 病毒与肿瘤发生病毒与肿瘤发生12.1.5 12.1.5 病毒的基因工程疫苗与病毒载体病毒的基因工程疫苗与病毒载体12.1.1 病毒基因组的结构病毒基因组的结构 不同类型的病毒，其基因组有很大差不同类型的病毒，其基因组有很大差异。在核酸类型上，有异。在核酸类型上，有DNA病毒病毒(如腺如腺病毒病毒)，有，有RNA病毒病毒(如反转录病毒如反转录病毒)，但对每一种病毒来说，它只能含有一但对每一种病毒来说，它只能含有一种核酸。种核酸。 从核酸结构上看，有的是单链核酸，有从核酸结构上看，

4、有的是单链核酸，有的是双链核酸，有的是线状，有的是环的是双链核酸，有的是线状，有的是环状。状。 一些单链一些单链RNA病毒的基因组还具有不同病毒的基因组还具有不同的极性，有的是正链的极性，有的是正链RNA，有的是负链，有的是负链RNA。 有的正链有的正链RNA病毒基因组病毒基因组5端有帽子结端有帽子结构，也有的正链构，也有的正链RNA病毒基因组病毒基因组3端有端有poly(A)尾结构。尾结构。 相对于能独立生活的微生物来说，病毒的基相对于能独立生活的微生物来说，病毒的基因组非常简单。病毒核酸的相对分子质量约因组非常简单。病毒核酸的相对分子质量约为为1.61071.6108，仅为一般细菌基因组，

5、仅为一般细菌基因组的的1l/10。 12.1.2 病毒基因组的复制和表达调控病毒基因组的复制和表达调控 病毒进入活的易感宿主细胞后，借助于病毒进入活的易感宿主细胞后，借助于宿主细胞本身提供的原料、能量、酶等，宿主细胞本身提供的原料、能量、酶等，以自我复制的方式进行繁殖。以自我复制的方式进行繁殖。 病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。 正链正链RNA病毒的基因组除了作为模板复制出病毒的基因组除了作为模板复制出子代子代RNA之外，还有之外，还有mRNA的作用。作为翻的作用。作为翻译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链，译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链，

6、然后再由蛋白酶降解为不同功能的结构蛋白然后再由蛋白酶降解为不同功能的结构蛋白等。等。 负链负链RNA病毒的基因组无病毒的基因组无mRNA的功能，的功能，必须由复制出的互补必须由复制出的互补RNA(cRNA)来发挥来发挥mRNA的作用。的作用。 12.1.3 病毒对宿主细胞的影响病毒对宿主细胞的影响 病毒只能在活细胞中存活，因此，病毒与宿主病毒只能在活细胞中存活，因此，病毒与宿主细胞之间有着十分密切的关系。病毒利用宿主细胞之间有着十分密切的关系。病毒利用宿主细胞的细胞器、能量和酶等进行自身的复制，细胞的细胞器、能量和酶等进行自身的复制，并通过宿主细胞的蛋白表达系统来表达自身所并通过宿主细胞的蛋白

7、表达系统来表达自身所需的蛋白质，这些过程都将会对宿主细胞的形需的蛋白质，这些过程都将会对宿主细胞的形态和功能产生重大的影响。态和功能产生重大的影响。 病毒对宿主细胞的影响主要体现在病病毒对宿主细胞的影响主要体现在病毒对宿主细胞毒对宿主细胞形态和结构形态和结构的影响以及的影响以及病毒对宿主细胞病毒对宿主细胞功能功能的影响两个方面。的影响两个方面。 12.1.4 病毒与肿瘤发生病毒与肿瘤发生 人类和动物肿瘤的形成除了与遗传和环境因人类和动物肿瘤的形成除了与遗传和环境因素相关外，某些素相关外，某些DNA和和RNA病毒也可以通过病毒也可以通过不同的机制诱发恶性肿瘤。不同的机制诱发恶性肿瘤。 有些病毒直

8、接作用于细胞的基因组，使细胞有些病毒直接作用于细胞的基因组，使细胞增殖，最终导致肿瘤形成；有些病毒则通过增殖，最终导致肿瘤形成；有些病毒则通过抑制机体的免疫系统，诱导细胞恶性转变，抑制机体的免疫系统，诱导细胞恶性转变，形成肿瘤。形成肿瘤。 有些病毒常伴随一些特定肿瘤的发生，有些病毒常伴随一些特定肿瘤的发生，但它们与肿瘤的关系还未得到确认但它们与肿瘤的关系还未得到确认.例如例如在艾滋病病人中引发的在艾滋病病人中引发的Kaposis肉瘤。肉瘤。 总之，大约总之，大约15%的恶性肿瘤与病毒有关，的恶性肿瘤与病毒有关，因此研究肿瘤的病毒病因具有十分重要因此研究肿瘤的病毒病因具有十分重要的意义。的意义。

9、12.1.5 病毒基因工程疫苗与病毒载体病毒基因工程疫苗与病毒载体 基因工程疫苗是指基因工程疫苗是指用基因工程的方法，用基因工程的方法，表达病原微生物的一段基因序列，将表表达病原微生物的一段基因序列，将表达产物达产物(多数是无毒性、无感染能力，但多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性具有较强的免疫原性)用作疫苗，用作疫苗，例如正例如正在使用的大多数乙型肝炎疫苗就是基因在使用的大多数乙型肝炎疫苗就是基因工程疫苗。工程疫苗。 常见的基因工程疫苗包括亚基疫苗和肽常见的基因工程疫苗包括亚基疫苗和肽疫苗两类。以流感疫苗为例，其途径就疫苗两类。以流感疫苗为例，其途径就是把病毒的免疫原蛋白是把病毒的

10、免疫原蛋白(HA抗原、抗原、NA抗抗原原)的的mRNA提取出来，再制备提取出来，再制备cDNA,克克隆到大肠杆菌中，高效表达该抗原。隆到大肠杆菌中，高效表达该抗原。 由于基因工程疫苗具有安全性好、产量由于基因工程疫苗具有安全性好、产量高、成本低，以及良好的免疫原性，它高、成本低，以及良好的免疫原性，它必将成为传统疫苗的有效替代疫苗。必将成为传统疫苗的有效替代疫苗。 12.2 DNA病毒的分子生物学病毒的分子生物学 DNA病毒基因组有单链和双链两种结构，病毒基因组有单链和双链两种结构，并以线状或环状形式存在，大部分为单并以线状或环状形式存在，大部分为单一分子，也有的由数个片段的一分子，也有的由数

11、个片段的DNA分子分子构成分段的基因组。构成分段的基因组。 动物动物DNA病毒多为双链病毒多为双链DNA基因组，腺病基因组，腺病毒、痘病毒、疱疹病毒都是双链线状毒、痘病毒、疱疹病毒都是双链线状DNA基因组，末端有重复序列，经退火能形成基因组，末端有重复序列，经退火能形成环形分子。环形分子。 腺病毒腺病毒(Aflenovirus)是一种典型的双链是一种典型的双链DNA病毒，下面以腺病毒的基因表达调控为例，病毒，下面以腺病毒的基因表达调控为例，简要介绍简要介绍DNA病毒的分子生物学。病毒的分子生物学。 12.2.1 腺病毒的发现腺病毒的发现 1953年，年，Rowe等人从外科手术摘除的儿等人从外科

12、手术摘除的儿童腺体中分离到一种致病因子，可以使童腺体中分离到一种致病因子，可以使培养的细胞发生慢性进行性病变，称之培养的细胞发生慢性进行性病变，称之为腺体退化因子，后来证明这种致病因为腺体退化因子，后来证明这种致病因子是病毒，子是病毒，1956年，年，Enders等建议命名等建议命名为腺病毒。为腺病毒。 腺病毒分布十分广泛，腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、从各种胎生哺乳动物、鸟类和两栖类动物中都已分离到。鸟类和两栖类动物中都已分离到。 腺病毒科分两个属：腺病毒科分两个属： 1 1、哺乳动物腺病毒属、哺乳动物腺病毒属 (Mastadenovirus) 2 2、禽腺病毒属、禽腺病毒属(A

13、riadenovirus)。 腺病毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些腺病毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致使细胞的功能失常。使细胞的功能失常。 腺病毒致癌的分子机理是目前分子病毒腺病毒致癌的分子机理是目前分子病毒学的一个重要研究领域。学的一个重要研究领域。 12.2.2 腺病毒的毒粒结构腺病毒的毒粒结构 完整的腺病毒颗粒其相对分子质量完整的腺病毒颗粒其相对分子质量1.7108-1.85108，沉降常数约，沉降常数约560S，在，在 CsCl中的中的密度为密度为1.321.35g/cm3。腺病毒对热和酸稳。腺病毒对热和酸稳定，能在肠道中

14、存活。腺病毒颗粒无包膜，定，能在肠道中存活。腺病毒颗粒无包膜，外边是蛋白外壳，中间为紧密的核心颗粒，外边是蛋白外壳，中间为紧密的核心颗粒，内含单一拷贝的双链内含单一拷贝的双链DNA。 12.2.3 腺病毒的基因组结构腺病毒的基因组结构 腺病毒基因组为线形双链腺病毒基因组为线形双链 DNA，人类腺，人类腺病毒基因组包括早期基因病毒基因组包括早期基因 E1A、 E1B、E2A、E2B、E3 和和 E4以及晚期基因以及晚期基因 L1、L2、L3、L4 和和 L5。 12.2.4 腺病毒的复制腺病毒的复制12.2.5 腺病毒的基因转录腺病毒的基因转录 12.2.6 腺病毒与肿瘤腺病毒与肿瘤 至今尚未发

15、现腺病毒感染与任何人类肿至今尚未发现腺病毒感染与任何人类肿瘤的关系。但许多的人类腺病毒却可以瘤的关系。但许多的人类腺病毒却可以使啮齿动物的培养细胞发生转化或使这使啮齿动物的培养细胞发生转化或使这些动物产生肿瘤。些动物产生肿瘤。 12.2.7 腺病毒作为基因治疗的载体腺病毒作为基因治疗的载体 腺病毒用作基因治疗载体和疫苗研制有着广腺病毒用作基因治疗载体和疫苗研制有着广阔的前景。腺病毒基因组的阔的前景。腺病毒基因组的E1区和区和E3区可以区可以作为外源基因的插入区。作为外源基因的插入区。E1区缺失的腺病毒区缺失的腺病毒可克隆约可克隆约4.7 kb的外源的外源DNA，而，而E3区缺失的区缺失的腺病毒

16、可以克隆约腺病毒可以克隆约8 kb的外源的外源DNA，一些特，一些特定的腺病毒株已被用于人类疫苗的研制。定的腺病毒株已被用于人类疫苗的研制。 腺病毒作为基因治疗载体有着以下几方腺病毒作为基因治疗载体有着以下几方面的优点：面的优点： (1)腺病毒基因组研究的比较清楚，便于腺病毒基因组研究的比较清楚，便于进行遗传操作。进行遗传操作。 (2)其感染一般不引起明显的症状，与宿其感染一般不引起明显的症状，与宿主染色体整合的机率很低，作为基因治主染色体整合的机率很低，作为基因治疗的载体比较安全。疗的载体比较安全。 (3)可以感染不同类型细胞，易于进行体可以感染不同类型细胞，易于进行体外培养，病毒感染细胞滴

17、度高，可在细外培养，病毒感染细胞滴度高，可在细胞内有效复制。胞内有效复制。 (4)腺病毒感染细胞后可以高水平的表达腺病毒感染细胞后可以高水平的表达蛋白，在感染后期，宿主基因表达被关蛋白，在感染后期，宿主基因表达被关闭，易于高水平表达外源基因。闭，易于高水平表达外源基因。 12.3 RNA病毒的分子生物学病毒的分子生物学 RNA病毒基因组均呈线状，有单双链之病毒基因组均呈线状，有单双链之分，有单一分子，也有的基因组是分段分，有单一分子，也有的基因组是分段的。的。RNA的二级结构对病毒基因表达调的二级结构对病毒基因表达调控有重要影响。控有重要影响。 下面介绍一种典型的下面介绍一种典型的RNA病毒，

18、黄病毒病毒，黄病毒科丙型肝炎病毒属的成员科丙型肝炎病毒属的成员丙型肝炎丙型肝炎病毒病毒(HCV)。 12.3.1 HCV的发现的发现 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒HCV(hepatitis C virus) 是是应用分子生物学技术对病毒进行研究的应用分子生物学技术对病毒进行研究的成功实例。成功实例。 12.3.2 HCV基因组的结构与功能基因组的结构与功能 HCV是有外膜的单正链是有外膜的单正链RNA病毒，基因病毒，基因组长约组长约l0000 nt。HCV仅有一个几乎为全仅有一个几乎为全基因组长度的翻译可读框基因组长度的翻译可读框ORF，编码，编码30103033个个AA的多聚蛋白，经过蛋白酶的多

19、聚蛋白，经过蛋白酶加工，切割成结构蛋白和调节蛋白。许多加工，切割成结构蛋白和调节蛋白。许多黑猩猩和人类黑猩猩和人类HCV毒株已被完全测序。毒株已被完全测序。 12.3.3 HCV基因组的复制基因组的复制 12.4 反转录病毒的分子生物学反转录病毒的分子生物学 反转录病毒基因组是线形正链反转录病毒基因组是线形正链RNA, , 正正链链RNA没有没有mRNA活性，需要在自身的活性，需要在自身的反转录酶的作用下，将正链反转录酶的作用下，将正链RNA反转录反转录成双链成双链DNA，通过向宿主细胞基因组的，通过向宿主细胞基因组的整合，在宿主细胞整合，在宿主细胞RNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下转录出转录

20、出mRNA。 人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)是最典型也是最是最典型也是最重要的反转录病毒。以下简要介绍重要的反转录病毒。以下简要介绍HIV的分子生物学。的分子生物学。 12.4.1 艾滋病与艾滋病与HIV 艾滋病是一种导致以全身免疫系统严重艾滋病是一种导致以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，人类免疫缺损害为特征的传染性疾病，人类免疫缺陷病毒陷病毒(HIV)是其病原体，感染者终生携是其病原体，感染者终生携带病毒，目前缺乏有效的治疗手段。带病毒，目前缺乏有效的治疗手段。 12.4.2 病毒的结构与生活周期病毒的结构与生活周期 HIV颗粒呈球形，直径约颗粒呈球形，直径约110 nm

21、, HIV颗颗粒可分为包膜、衣壳和病毒核心三部分。粒可分为包膜、衣壳和病毒核心三部分。核心内部是两个长度为核心内部是两个长度为9.2kb的的单股正链单股正链RNA，核心外侧为核心外侧为脂质双层脂质双层组成的外膜，组成的外膜，膜上有穿膜蛋白膜上有穿膜蛋白gp41和外膜蛋白和外膜蛋白gpl20。 HIV的生活周期包括以下阶段：的生活周期包括以下阶段：吸附，吸附， 侵入和脱壳，侵入和脱壳，反转录，反转录，整合，整合，病病毒毒RNA和蛋白质的合成，和蛋白质的合成，装配，装配，释放，释放，成熟。成熟。 12.4.3 病毒基因组的结构与功能病毒基因组的结构与功能 人免疫缺陷病毒属于反转录病毒科慢病人免疫缺

22、陷病毒属于反转录病毒科慢病毒属，分毒属，分HIV-1型和型和HIV-2型。型。 HIV基因组两个相同的正链基因组两个相同的正链RNA每条链每条链均包含了均包含了HIV结构与功能所需的遗传信结构与功能所需的遗传信息，两条息，两条RNA单链被核衣壳蛋白所包裹，单链被核衣壳蛋白所包裹，并通过其并通过其5端非共价结合，形成二聚体。端非共价结合，形成二聚体。 在在HIV基因组基因组RNA的的5端具有帽子结构，端具有帽子结构，3端端有有poly(A)尾巴，在反转录并整合后所形成的前病尾巴，在反转录并整合后所形成的前病毒毒cDNA的两端，为长末端重复序列的两端，为长末端重复序列(LTR)。LTR具有启动子和

23、增强子的双重功能。具有启动子和增强子的双重功能。 HIV基因组长约基因组长约9.2 kb。能编码至少。能编码至少17种蛋种蛋白质，除具有与其他反转录病毒相似的白质，除具有与其他反转录病毒相似的gag、pot和和env基因外，还可编码多种调节蛋白，基因外，还可编码多种调节蛋白，因此因此HIV又被称为复杂性反转录病毒。这又被称为复杂性反转录病毒。这些基因的排列十分紧凑，部分区域有重叠，些基因的排列十分紧凑，部分区域有重叠，除少数为断裂基因外，多数基因是连续的。除少数为断裂基因外，多数基因是连续的。 在在HIV基因组中，有三个编码结构蛋白基因组中，有三个编码结构蛋白和酶的基因，分别称为和酶的基因，分

24、别称为gag、pol和和env，其中其中gag与与pol使用不同的阅读框架，并使用不同的阅读框架，并有部分重叠。此外，还包括有部分重叠。此外，还包括6个编码调节个编码调节蛋白的基因。蛋白的基因。 12.4.4 HIV基因转录的调节基因转录的调节 在宿主体内，病毒基因的表达及调节是病毒与在宿主体内，病毒基因的表达及调节是病毒与细胞相互作用的集中体现。与那些简单的反转细胞相互作用的集中体现。与那些简单的反转录病毒相比，录病毒相比，HIV具有更完善的表达调控系统。具有更完善的表达调控系统。 一方面可以直接利用宿主细胞的调节机制，一方面可以直接利用宿主细胞的调节机制，另一方面又能编码自身的调节蛋白。另

25、一方面又能编码自身的调节蛋白。 宿主细胞转录因子和病毒调节蛋白在病毒宿主细胞转录因子和病毒调节蛋白在病毒RNA的转录、转录后加工、翻译和翻译后修的转录、转录后加工、翻译和翻译后修饰等各个环节中都能发挥重要的作用。饰等各个环节中都能发挥重要的作用。 而宿主以及与而宿主以及与HIV共感染的其他病毒，也共感染的其他病毒，也能借助于细胞因子和病毒基因产物来调节能借助于细胞因子和病毒基因产物来调节病毒基因的表达。病毒基因的表达。 由此形成了错综复杂的调节网络，可以精由此形成了错综复杂的调节网络，可以精细地调节病毒基因转录和翻译过程的启动、细地调节病毒基因转录和翻译过程的启动、关闭及其速率，按照既定程序完

26、成病毒复关闭及其速率，按照既定程序完成病毒复制的过程。制的过程。 与真核细胞基因表达过程相对应的是，与真核细胞基因表达过程相对应的是，HIV基因表达的调节表现为多级调控系统，存在基因表达的调节表现为多级调控系统，存在着多个调控点，可大体划分为转录水平的调着多个调控点，可大体划分为转录水平的调节、转录后水平的调节、翻译水平调节和翻节、转录后水平的调节、翻译水平调节和翻译后水平的调节，其中转录水平的调节，是译后水平的调节，其中转录水平的调节，是HIV调节基因表达的主要环节。调节基因表达的主要环节。 12.4.5 病毒基因转录后的调控病毒基因转录后的调控 HIV mRNA的加工和转运是在病毒基因产物和细胞的加工和转运是在病毒基因产物和细胞调节因子的协同作用下完成的。调节因子的协同作用下完成的。HIV可以通过它的可以通过它的加帽位点和加帽位点和poly(A)信号完成信号完成mRNA的加帽和加尾的加帽和加尾修饰；并利用其修饰；并利用其RNA基因组中存在的至