第十二届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品

1、目录摘要:2Abstract:31 绪论41.1京尼平的特性41.2 京尼平的制备及应用现状41.3 京尼平的制备和应用的研究意义42 实验仪器与材料62.1实验仪器62.2实验材料63 原理与方法73.1原理73.2 方法73.2.1固定化酶的制备黑曲霉发酵产-葡萄糖苷酶 -葡萄糖苷酶和菌丝的共固定化83.3 固定化酶催化栀子苷水解条件的优化：83.4 京尼平的纯化及结晶83.5 京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素93.6 京尼平作为交联剂94 结果与分析104.1京尼平的制备实验结果与分析104.2 京尼平纯化实验结果与分析104.2.1 树脂吸附京尼平效果分析1

2、04.2.2 京尼平结晶114.2.3 京尼平纯度测定114.3 京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素实验结果与分析124.4 京尼平与赖氨酸显色反应过程中吸光度的变化：134.4 京尼平作为交联剂实验的结果与分析145 讨论15参考文献：15附录：已录用文献161高色价栀子蓝色素的制备及其稳定性研究162京尼平的分离纯化及高效液相色谱法测定223高效液相色谱法同时测定京尼平和栀子苷28京尼平的制备，纯化及应用摘要:目的 （一）通过对京尼平制备，纯化条件的实验研究，摸索出稳定生产高纯度京尼平的条件。（二）通过对京尼平特性的了解和进一步研究，开发出其新的应用领域，让其更好的造福人类。方法 本实验研究的内

3、容及步骤包括：固定化-葡萄糖苷酶的条件优化实验，-葡萄糖苷酶水解栀子苷条件的实验，京尼平的纯化实验，京尼平制备栀子蓝色素条件实验，京尼平用作生物交联剂的实验。结果 京尼平是可以通过-葡萄糖苷酶在55、pH=5.0，水解栀子苷制得的，转化液经树脂HPD700吸附洗脱和结晶处理后，京尼平纯度可得到98%以上，京尼平在适当条件下与Lys、Arg反应制得的栀子蓝色素与等量的其他氨基酸相比色价最高，在作为固定化酶交联剂方面，京尼平与戊二醛相比，前者所得固定化酶具有酶活损失率低，使用周期长等优点。结论 本实验所用的方法可以制的高纯度的京尼平，京尼平与氨基酸反应可以得到高色价栀子蓝色素，并且发现它有着传统交

4、联剂无可比拟的优势。Preparation of genipin, purification and application Abstract:objective genipin preparation,purification conditions experimental study, and explore the stable production of high purity genipin,Further study the application of genipin. Methods The experiment including: hydrolysis of genipin

5、 high enzyme activity of the immobilized enzyme, -glucosidase geniposide conditions of hydrolysis, conversion of liquid genipin purified preparation of genipin Conditions of gardenia blue pigment, crosslinker genipin for Experimental Biology. Results Genipin can be achieved through -glucosidase in 5

6、5, pH5.04 geniposide hydrolysis system, the transformation solution was obtained after adsorption resin HPD7100 more than 98% of genipin, genipin and Lys, Arg Preparation of plain blue gardenia highest price, in the immobilized enzyme as a crosslinking agent when compared with genipin and glutaralde

7、hyde immobilized enzyme lost little activity, the use of the advantages of a longer time. Conclusion The method used in this study can be made of high purity genipin, genipin reaction with the amino acids can be High Gardenia blue pigment, and found it an unparalleled advantage in a traditional cros

8、s-linking agent. 1 绪论1.1京尼平的特性 京尼平（genipin）来源于茜草科植物栀子，它是一种环烯醚萜类的白色化合物（结构如图1-1）。京尼平可以解除线粒体解耦联蛋白2（Uncoupled Protein 2, UCP2）对胰岛素释放的抑制，改善II型糖尿病症状1，有望成为糖尿病治疗的新型药物。另外，京尼平在生物材料2,3、药物合成4、药物控释5等领域也有广泛应用。也可以用于食品工业生产栀子蓝色素6,7；它能与含氨基的化合物进行交联反应，细胞毒性小，而且相容性好。 京尼平分子式 京尼平结晶照片图 1-1 京尼平1.2 京尼平的制备及应用现状参考已发表的专利、文献，目前京尼

9、平的生产主要是通过微生物发酵工程，如利用青霉菌产生的-葡萄糖苷酶水解栀子苷，再用大孔树脂吸附，洗脱液用硅胶柱进一步纯化，最后结晶和重结晶得到京尼平9,10，各步骤选用方法材料和反应条件的控制是关键。目前报道的京尼平可应用到与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂11,12。也可用于治疗肝脏疾病、降压、通便、缓解II型糖尿病的症状等。京尼平也可用做指纹采集试剂和制备高色价栀子蓝色素。京尼平还可用作药物合成的中间体、皮革鞣制工艺的绿色鞣剂等131.3 京尼平的制备和应用的研究意义如上所述，京尼平有如此之多的应用价值，但是由于

10、目前京尼平的制备技术不成熟，导致成本过高，限制了京尼平应用到各个领域去，所以探索出一条简单制备京尼平的技术迫在眉睫。京尼平可以用作制备高色价的栀子蓝色素，栀子蓝色素是一种安全无毒的食用天然色素，它耐热、耐光、耐酸碱，pH适应范围广，易溶解于水和低醇，可替代化学合成蓝色素单独使用，也可以与红、黄类色素调配成绿、紫、棕等色调混合使用，在国外被广泛应用于食品、药品及化妆品等产品的着色，具有很高的应用价值14,15。但是目前应用的微生物发酵栀子制备栀子蓝色素，不仅污染大，而且引入杂质多，导致所得栀子蓝色素的色价不高，而直接用京尼平为原料与氨基酸反应就可以避免这些缺点，从而得到高色价栀子蓝色素。2 实验

11、仪器与材料2.1实验仪器 分析天平（JA3003）、层析柱（上海煊盛生化科技有限公司）、Olympus CX41显微摄像系统、上海新苗DNP-9052BS-III电热恒温培养箱和DHG-9073BS-III恒温鼓风干燥箱、无菌操作台、高效液相色谱（日本岛津）、UV751GD紫外分光光度计、旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限工日）、数显恒温水浴锅、锥形瓶等 高效液相色谱 层析柱2.2实验材料98%栀子苷（临川之信生物科技有限公司）、黑曲霉（中科院）、pda培养基、海藻酸钠（上海国药试剂）、戊二醛、明胶 、乙酸、氢氧化钠、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚 等氨基酸: Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln

12、、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val（上海源聚生物科技有限公司）大孔树脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD700（沧州宝恩化工）；大孔树脂HZ201、HZ801、802、803（上海华震科技贸易公司）3 原理与方法3.1原理京尼平（Genipin）是栀子苷经-葡萄糖苷酶水解后的产物。因此，我们以高纯栀子苷为原料，采用-葡萄糖苷酶水解（原理见图3-1），再经吸附、洗脱、旋转蒸发、重结晶、低温干燥而制得。在制备的过程中我们分别对反应的最适PH、温度、反应时间进行了试验，得出最适条件。图 3-1 反应式由于京尼

13、平分子中隐含有独特的戊二醛结构，可以与伯氨基化合物发生反应生成蓝色化合物（反应机理见图3-2），所以可以通过实验得出一种氨基酸与京尼平在特定条件反应制备相对较高的栀子蓝色素。图3-2 京尼平与氨基交联京尼平可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联，将京尼平用于固定化酶的交联，与传统交联剂戊二醛作比较，比较其交联效果。 3.2 方法本项目所研究的内容涉及到这几个方面:固定化酶制备京尼平及其条件的探索及优化实验；京尼平纯化条件探索及优化实验 ；氨基酸与京尼平反应制备栀子蓝色素的条件探索实验；京尼平作为交联剂制备固定化-葡萄糖苷酶。3.2.1固定化酶的制备黑曲霉发酵产-葡萄糖苷酶 通过参

14、考文献得出黑曲霉产-葡萄糖苷酶的最佳培养基和培养条件麦麸发酵培养基：麦麸20g/L (NH4)2SO4 6 gL，葡萄糖 5g/L 蛋白胨 4g/L KH2PO4 5 gL， MgSO4 1 gL， 吐温（适量加入）摇瓶发酵培养：在250 mL三角瓶中加入7O mL麦麸培养基，接人种子培养液，摇瓶培养4 d，然后过滤收集菌丝，并用少量蒸馏水洗涤菌丝，除去菌种表面少量培养基，再用等体积的0.85NaCl溶液悬浮菌丝体 16。 -葡萄糖苷酶和菌丝的共固定化取海藻酸钠6g放入100水中，在高温度下煮透使海藻酸钠使其均匀溶解与水中，放在室温下静置室温，向中所得菌丝培养液取1

15、00ml并加入明胶和0.5%的戊二醛充分混匀后放入冰箱交联2h小时，取出上述交联后菌丝培养液与煮好的海藻酸钠混合均匀之后用注射器制出直径约20mm的球状颗粒酶放入3%CaCl2 100ml中充分钙化两小时，取出滤干保存备用。测得酶活最佳pH为4.5，固定化酶活最适温度为5517,18。3.3 固定化酶催化栀子苷水解条件的优化：3.3.1 取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml， pH调到7，分别在25、35、45、55、65、80水解，反应2h取样稀释适当的倍数检测转化率。3.3.2 取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml，由3.31的最佳条温度，pH分别为4、5、6、7、8、

16、9，反应2h取样稀释适当的倍数检测转化率。 3.3.3 取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml，在2.32的最佳pH和3.31的最佳条温度的条件下水解，每隔一个小时取一次样，取样稀释适当的倍数检测转化率。3.4 京尼平的纯化及结晶3.4.1 选取8种树脂，分别称取5g，用无水乙醇处理一个小时，取9个100ml锥形瓶，编号19，将处理好的树脂分别加到18号锥形瓶中，9号做空白参照，加入经水解后得到的京尼平原溶液20 mL，室温振荡吸附12 hr。然后按文献19方法分别取2 mL吸附前和吸附后的京尼平原溶液，加入2 mL精氨酸80水浴显色1 hr，测定590 nm处的吸光度值。3.4.2

17、将得到的京尼平粉末分别溶解到甲醇、乙醇、丙酮、乙醚中直到饱和，观察出结晶的时间及晶体的量，用高效液相色谱检测每种方法所得晶体的纯度。3.5 京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素3.5.1 精确称取京尼平6.69g，用pH7.0的乙酸-氢氧化钠溶液溶解，定容后得到0.1mol/L的京尼平溶液300mL。再根据氨基酸分子量的不同，称取一定数量的20种氨基酸，分别用pH7.0的乙酸-氢氧化钠溶液溶解，定容后得到0.1mol/L的各种氨基酸溶液各10mL。分别取10mL 0.1mol/L的京尼平溶液与10mL 0.1mol/L的氨基酸溶液混合，80水浴反应，每隔1hr取样用紫外可见分光光度计扫描最大吸收波长及

18、吸光度值，直到吸光度值不再增大，即停止反应。按文献方法测定色价19。3.5.2分别取50mL 0.1mol/L的京尼平溶液与100mL 0.1mol/L的赖氨酸溶液混合，参考文献方法20显色，即显色温度为80，显色时间为16hr。分别取混合后0min，20min，16hr的样品，用紫外可见分光光度计扫描，得到扫描曲线和最大吸收波长及吸光度值。3.6 京尼平作为交联剂发酵液过滤后滤液用DNS法检测-葡萄糖苷酶酶活16。取50ml滤液加入终浓度为1%的京尼平交联过夜，再与50ml浓度为6%的海藻酸钠溶液混匀，然后用注射器缓慢滴到3%氯化钙溶液中，硬化30min后分离固定化酶和氯化钙溶液，分别测定两

19、者酶活。以1%戊二醛为对照组，按同样方法交联后，分别测定固定化酶和氯化钙溶液的酶活。4 结果与分析4.1京尼平的制备实验结果与分析按方法3.3.1,3.3.2,3.3.3，得出各种条件下-葡萄糖苷酶水解栀子苷的转化率见表1。温度、 时间、 PH / 转化率 温度（） 时间（h） PH25 23.5% 1h 36.5% 3.0 36.5%35 46.5% 2h 66.5% 4.0 43.5%45 70.6% 3h 86.4% 4.5 93.7%55 96.5% 4h 98.5% 5.0 97.8%65 58.7% 5h 99.6% 6.0 85.5%80 13.0% 6h 99.7% 8.0 2

20、5.5% 表一 水解转化率从表1列出了在不同PH下固定化-葡萄糖苷酶水解浓度为1%栀子苷液中的转化率的改变情况。可以看出在酸性情况下由于酶处于强酸或强碱的酸性环境中构像发生改变，从而影响酶水解底物的反应。另外也可看出固定化-葡萄糖苷酶在催化栀子苷的反应中温度对反应的影响很大。当酶与底物作用时，低温将会抑制酶的活性而高温则会引起酶的构象严重畸变失活从而影响反应的进程。 在固定化-葡萄糖苷酶催化栀子苷反应生成京尼平的过程中，随着反应的进行底物浓度在不断的降低，反应速率也在不变化。所以讨论反应什么时候结束尤为重要。表1所示的反应时间对转化率的影响反应了催化的进程，并得出经过3h后底物基本被转化完全。

21、4.2 京尼平纯化实验结果与分析4.2.1 树脂吸附京尼平效果分析按3.4.1方法，检测经树脂吸附后液体在590nm下的吸光度，数据见表2.大孔树脂吸附前A590nm（稀释10倍）吸附后A590nm(稀释2倍)吸附率HPD1000.360.46374.27%HPD3000.360.47673.55%HPD4000.360.35980.05%HPD7000.360.06396.50%HZ2010.360.66363.16%HZ8010.360.47373.72%8020.360.46074.45%8030.360.43076.11%表2 树脂吸附京尼平试验数据由以上数据可以看出HPD700吸附京

22、尼平的效果最好。转化液经HPD700的吸附洗脱，旋转蒸发，得到京尼平粉末（见图4-1） 图 4-1 京尼平粉末4.2.2 京尼平结晶按方法3.4.2，京尼平粉末在甲醇中和乙醇中结晶效果差不多，出晶体的时间再3个小时左右，晶体量多，在丙酮中出的晶体最好，但是晶体量不多而且一天才能出晶体，乙醚效果最差。由于甲醇不安全，丙酮的出晶体时间长和量不多，所以乙醇用作京尼平的结晶最好，显微摄像系统下的乙醇结晶图见4-2 图4-2 京尼平晶体4.2.3 京尼平纯度测定样品制备:精密称取京尼平20mg，用流动相（甲醇与50mmol NaH2PO4水溶液比例为40：60）溶解后置于100ml 容量瓶中，定容，得到

23、0.2mg/ml的京尼平样品。色谱条件:波长238nm，大连依利特Hypersil C8柱（5mm*200mm;5um），流动相为甲醇：50mmol NaH2PO4水溶液，比例为40：60，流速为0.6ml/min。进样量为10ul。检测结果:用峰面积对照标准曲线计算，京尼平纯度大于98%。4.3 京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素实验结果与分析按方法3.5.1，将不同氨基酸分别与京尼平反应，测定反应产物的最大吸收波长和吸光度值，结果见表3。测定反应后产物的色价，结果见表3。序号氨基酸总类最大吸收波长maxmax的吸光度值色价E1%1cm1Ala (丙氨酸)5991.0041222Arg (精氨酸)

24、6002.9361653Asn天冬酰胺6080.312524Asp天冬氨酸5880.190365Cys(半胱氨酸)5990.414656Gln(谷氨酰胺)5990.613787Glu(谷氨酸)6031.3151258Gly (甘氨酸)5991.4501379His(组氨酸)5980.8539510Ile(异亮氨酸)6000.4947311Leu(亮氨酸)5990.5648112Lys (赖氨酸)5913.96418013Met(甲硫氨酸)6120.6058514Phe(苯丙氨酸6050.6769115pro(脯氨酸)0.079 16Ser(丝氨酸)6000.6218617Thr(苏氨酸)601

25、0.3015318Trp(色氨酸)5870.3445919Tyr(酪氨酸)5910.3145220Val(缬氨酸)6010.4957321空白对照0.070 表3不同氨基酸与京尼平的呈色反应结果从表可以知大部分氨基酸与京尼平的反应产物最大吸收波长都在595600nm之间，只有Pro与Trp 呈色效果不明显。赖氨酸和精氨酸与氨基酸反应的到栀子蓝色素的色价高。图4-3是赖氨酸与京尼平反应到的栀子蓝色素。 图4-3 栀子蓝色素4.4 京尼平与赖氨酸显色反应过程中吸光度的变化：按方法3.5.2采用紫外可见分光光度计监测赖氨酸与京尼平的显色反应进程，分别用全波长扫描混合后0min，20min，16hr的

26、3个样品，得到3条扫描曲线如图4-4所示。图4-4京尼平与赖氨酸显色0min、20min和16hr紫外可见光谱扫描曲线图由图4-3可知，混合后0min的样品在238nm处有一吸收峰，反应20min后在291nm处出现一个新的吸收峰，16hr后238nm处的吸收峰消失，出现590nm吸收峰。由扫描结果图可知，京尼平与赖氨酸反应是个缓慢的过程，首先生成一个在291nm有吸收峰的中间产物，然后才生成栀子蓝色素。4.4 京尼平作为交联剂实验的结果与分析按3.6方法京尼平戊二醛分别用于固定化酶交联，结果比较如表4 京尼平组戊二醛组颜色深蓝色淡黄色质地柔软有弹性柔软有弹性固定化酶总酶活 1138

27、.7U/h 524.3U/h酶活回收率 86.7%51.2% 表4 京尼平、戊二醛交联试验由表4可知，京尼平用作固定化酶交联剂时，除了有传统交联剂的特性，它用作固定化酶交联时酶活损失少，回收率比戊二醛高30%多。图4-5是京尼平与戊二醛交联效果图比较。 图4-5 固定化酶5 讨论（1）通过实验结果来看，采用固定化-葡萄糖苷酶催化栀子苷制备京尼平的方法确实为一种合理的催化反应，同传统的微生物发酵产酶进行液体水解栀子苷的方法相比具有高效、无污染等优点，分析其原因，可能与实验过程中更好地利用固定化酶的使用周期长，不会产生副产物且催化过程中不会带入杂质等优点，大大简化了京尼平的纯化工艺，为制得高纯度的

28、京尼平提供了条件。（2）在京尼平的纯化试验过程中通过对多种树脂对京尼平的吸附、洗脱试验，得到了吸附效果好，易洗脱并在洗脱的过程中不会带有杂质，这也为后面京尼平的进一步精制提供了条件。在京尼平的精制的过程中通过对京尼平的极性，溶解性等多种化学性质进行分析，设计出多种适合其结晶的条件，并进行京尼平的结晶条件的优化。最终得到能短时间内得到大量且纯度高达98%的京尼平晶体。（3）在栀子蓝色素的制备方面，我们通过对20种氨基酸与京尼平呈色反应进行实验，发现其反应效果最好的氨基酸赖氨酸，并对赖氨酸与京尼平的反应进程进行了细化研究，最终发现栀子蓝色素的制备过程有中间产物存在，这位今后的制备高色价的栀子蓝色素

29、提供了大量的数据。（4）在京尼平作为交联剂的应用方面，我们通过其与戊二醛对比，发现京尼平做为交联剂所得固定化-葡萄糖苷酶的酶活更高，这也填补了京尼平作为交联剂制备固定化酶的空白。可以预测京尼平将作为一种天然、高效的交联剂被广大科研工作者运用。参考文献：1 MI F L,SHYU S S,PENG C K.Characterization of ring-opening polymerization of genipin and pH-dependent cross-linking reactions between chitosan and genipinJ.Journal of Polyme

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37、州，344000）摘要： 研究20种氨基酸与京尼平的呈色反应及部分反应产物的稳定性。分别将20种氨基酸与京尼平在80反应16hr，再用HPD100大孔树脂吸附栀子蓝色素，然后用80%乙醇水溶液洗脱色素，洗脱液在50进行减压干燥，得到深蓝色粉末，测定其色价，然后研究固体状态的栀子蓝色素的光照稳定性和温度稳定性。20种氨基酸与京尼平反应后生成的栀子蓝色素最大吸收波长大都在590600nm之间，其中赖氨酸色价E1%1cm最高，达180，其次是精氨酸和甘氨酸，脯氨酸呈色效果最差；通过稳定性试验结果表明，太阳光和日光灯照射对3种栀子蓝色素稳定性影响较小，紫外线影响稍大。赖氨酸与京尼平反应生成的栀子蓝色素

38、固体粉末低温稳定性好，高温下稳定性下降。赖氨酸、精氨酸和甘氨酸与京尼平反应生成的栀子蓝色素色价高，稳定性好，有较好的应用价值。关键词：栀子蓝色素；京尼平；氨基酸；色价Study on preparation and stabilityof high color value gardenia blueXU You-zhi1 LIANG Hua-zheng1* CHEN He1,2 HE Yu-lan1 LI Yuan1 (East China Institute of Technology，Biology Department，Fuzhou,Jiangxi,3440002.Linchuan Zh

39、ixin Biotechnology Co., Ltd.,Fuzhou 34400,China)Abstract:The color reaction of 20 amino acids with genipin were studied,and the stability of the reaction products gardenia blue were studied too. We use 20 amino acids to react with genipin respectively at 80 for 16hr, HPD100 resin to adsorb the garde

40、nia blue,then use 80% ethanol to elute,the elution were dried at 50,the gardenia blue were obtained.We also studied the stability of solid gardenia blue to light,UV and temperature.The results showed that the max of the reaction products are almost between 590-600nm ,the color of the reaction produc

41、ts of Lys, Arg and glycine with genipin are strong, but the color of the reaction products of Pro with genipin is very weak.The results of stability experiments showed, the solid gardnia blue is stable to light or heat,but little poor to UV.Key words: Gardenia blue; Genipin; Amino acid; Color value中

42、图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：栀子蓝色素（gardenia blue）是一种天然水溶性色素，它耐热、耐光、耐酸碱，pH适应范围广，广泛应用于食品、药品及化妆品等的着色1,2。栀子蓝色素的制备方法一般采用产-葡萄糖苷酶的微生物发酵栀子黄色素废液，将其中的栀子苷水解为京尼平，再与氨基酸反应而制得，该方法制备的栀子蓝色素纯度不高、色价低，原因在于发酵液中有多种氨基酸存在，它们可以与京尼平发生显色反应，并且发酵液成份复杂，给栀子蓝色素的提纯带来困难3,4。另外，也有报道直接采用-葡萄糖苷酶水解栀子苷得到京尼平，再与氨基酸反应显色得到栀子蓝色素5,6，这种方法的缺点在于水解液中-葡

43、萄糖苷酶可以与水解生成的京尼平反应，造成较大的浪费。京尼平与氨基酸的显色反应机理如图1所示7,8。图1京尼平与氨基酸的反应机理示意图本文研究了提纯后的京尼平与20种氨基酸显色反应，制备得到高色价的栀子蓝色素产品，并研究了产物的稳定性，为栀子蓝色素的生产应用打好基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂京尼平（98%，临川之信生物科技有限公司）；Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val（分析纯，上海源聚生物科技有限公司）；大孔吸附树脂HPD100（沧州宝恩化工有限公司）；其他试剂均为

44、分析纯，所用水为蒸馏水。1.2 主要仪器 UV-260紫外可见分光光度计(日本岛津)；PHS-2F数字酸度计（上海雷磁公司）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；电热真空干燥箱ZK-82B（上海实验仪器厂有限公司）。1.3 实验方法1.3.1 京尼平与氨基酸溶液的配制：精密称取京尼平22.623g，用50mM的pH7.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，定容后得0.1mol/L的京尼平溶液1000mL。分别称取20种氨基酸一定量，用蒸馏水溶解后定容，配制成0.1mol/L的氨基酸溶液各100mL。1.3.2氨基酸与京尼平的显色反应：分别取50mL 0.1mol/L的京尼平溶液与100mL 0.

45、1mol/L的20种不同的氨基酸溶液混合，参考文献方法9显色，即显色温度为80，显色时间为16hr。1.3.3 紫外可见分光光度计监测氨基酸与京尼平的显色反应进程按方法1.3.2进行氨基酸与京尼平显色反应，分别取混合后0min，20min，16hr的样品，用紫外可见分光光度计扫描，得到扫描曲线和最大吸收波长及吸光度值。1.3.4栀子蓝色素色价的测定：按方法1.3.2将京尼平分别与20种氨基酸进行显色反应，显色反应完成后，将反应液用HPD100大孔树脂吸附栀子蓝色素，然后用80%乙醇水溶液洗脱色素，洗脱液在50进行减压干燥，得到深蓝色固体，称量，测定其色价。栀子蓝色素色价E1%1cm可按下式计算

46、10：E1%1cm（590 nm）=AV/100mE1%1cm：表示用1的比色皿，波长为590nm，栀子蓝色素溶液浓度为1%时的色价 A：栀子蓝色素溶液的A590nm值 V：栀子蓝色素溶液的体积，单位mLm：栀子蓝色素质量，单位g1.3.5栀子蓝色素色价光照稳定性实验按方法1.3.2，分别将赖氨酸、精氨酸和甘氨酸与京尼平进行显色反应，然后按方法1.3.4制得3种栀子蓝色素粉末，各取1.0 g平铺成1cm2，分别用自然太阳光暴晒、日光灯照射或紫外线照射，每隔一定时间后取样50mg，配制成溶液并测其吸光度值，计算色素残存率。1.3.6栀子蓝色素色价温度稳定性实验按方法1.3.2，将赖氨酸与京尼平进

47、行显色反应，然后按方法1.3.4制得栀子蓝色素粉末，取1.0 g平铺成1cm2，置于30、60、90的恒温箱中保存，每隔一定时间后取样50mg，配制成溶液并测其吸光度值，计算色素残存率。2 结果与讨论2.1 京尼平与赖氨酸显色反应过程中吸光度的变化：按方法1.3.3采用紫外可见分光光度计监测赖氨酸与京尼平的显色反应进程，分别用全波长扫描混合后0min，20min，16hr的3个样品，得到3条扫描曲线如图2所示。图2京尼平与赖氨酸显色0min、20min和16hr紫外可见光谱扫描曲线图由图2可知，混合后0min的样品在238nm处有一吸收峰，反应20min后在291nm处出现一个新的吸收峰，16

48、hr后238nm处的吸收峰消失，出现590nm吸收峰。由扫描结果图可知，京尼平与赖氨酸反应是个缓慢的过程，首先生成一个在291nm有吸收峰的中间产物，然后才生成栀子蓝色素。2.2京尼平与20种氨基酸显色反应产物的色价及最大吸收波长按方法1.3.2将20种氨基酸分别与京尼平反应，测定反应终点时溶液的最大吸收波长和吸光度值，结果见表1。然后按方法1.3.4测定不同氨基酸显色所得的栀子蓝色素的色价，结果见表1。表1 不同氨基酸与京尼平的呈色反应结果序号氨基酸总类最大吸收波长maxmax处吸光度值（×200）色价E1%1cm（590 nm）1Ala (丙氨酸)5991.041222Arg (

49、精氨酸)5962.931653Asn天冬酰胺6010.3152.24Asp天冬氨酸5950.1936.55Cys(半胱氨酸)5970.4165.66Gln(谷氨酰胺)5990.6178.57Glu(谷氨酸)6001.311258Gly (甘氨酸)5931.451379His(组氨酸)5980.8595.810Ile(异亮氨酸)6000.4973.311Leu(亮氨酸)5990.5681.512Lys (赖氨酸)5903.9618013Met(甲硫氨酸)6020.6585.814Phe(苯丙氨酸6050.6791.715pro(脯氨酸)/0.00 /16Ser(丝氨酸)6000.6286.617

50、Thr(苏氨酸)6010.3053.518Trp(色氨酸)5870.3459.519Tyr(酪氨酸)5910.3152.820Val(缬氨酸)6010.4973.621空白对照/0.00 /由表1可知，大部分氨基酸与京尼平的反应产物最大吸收波长都在590600nm之间，呈亮丽的蓝色。呈色较深的氨基酸有赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸，呈色较浅的氨基酸有天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和酪氨酸，脯氨酸几乎不显色。反应液用HPD100大孔树脂吸附栀子蓝色素，然后用80%乙醇水溶液洗脱色素，洗脱液经50减压干燥，得到的固体色价最高的为赖氨酸，其次是精氨酸和甘氨酸。2.3京尼平与3种氨基酸显色反应产物

51、的稳定性栀子蓝色素的稳定性研究已有报道1,2，但一般都是以栀子蓝色素溶液为考察对象，本实验主要研究固体状态的栀子蓝色素的稳定性，并主要研究其对光照和温度的稳定性。2.3.1 光照条件对栀子蓝色素稳定性的影响 室外光照对栀子蓝色素稳定性的影响按方法1.3.5将赖氨酸、精氨酸和甘氨酸与京尼平反应生成的3种栀子蓝色素粉末，各取1.0 g平铺置于室外，用自然太阳光暴晒，光照强度平均1200lx，每暴晒1d后取样，配制成溶液并测其吸光度值，结果如表2。由表2可知，7d后3种栀子蓝色素的残留值都在90以上。表2 室外太阳光对3种氨基酸与京尼平反应产物稳定性的影响光照时间(d)01234567

52、7d残存率（）赖氨酸0.6990.6910.6780.6810.6550.6440.6390.63390.56精氨酸0.5650.5630.5510.5450.5360.5330.5340.52893.36甘氨酸0.3050.3030.3010.2950.2890.2860.2870.28091.80 室内光照对栀子蓝色素稳定性的影响按方法1.3.5将制得赖氨酸、精氨酸和甘氨酸与京尼平反应生成的3种栀子蓝色素粉末，各取1.0 g平铺置于室内40瓦日光灯处光照，光照强度为300lx，每照4d后取样，配制成溶液并测其吸光度值，结果如表3。由图3可知，28d后蓝色素的残留量在97以上。

53、表3 日光灯对3种氨基酸与京尼平反应产物稳定性的影响光照时间(d)048121620242828d残存率（）赖氨酸0.6990.6970.6940.6900.6890.6870.6840.68197.42精氨酸0.5650.5660.5620.5630.5580.5600.5560.55798.58甘氨酸0.3050.3020.3030.3050.3010.2890.2980.29998.0 紫外线对栀子蓝色素稳定性的影响按方法1.3.5 将制得赖氨酸、精氨酸和甘氨酸与京尼平反应生成的栀子蓝色素粉末，各取1.0 g平铺置于室内40瓦紫外灯30厘米处照射，每照1hr后取样，配制成溶液并测其吸光度值，结果如表4。由表4可知，6hr后蓝色素的残留量均在89以上。表4 紫外线对3种氨基酸与京尼平反应产物稳定性研究光照时间（hr）01234566hr残存率（）赖氨酸0.6990.6860.6730.6610.6480.6300.