NK细胞对小鼠H(一)

1、NK 细胞对小鼠 H(一)作者：张梅 ,吴迪，徐汇 ,贺鹏程，李静，习杰英，蔡瑞波，刘亚琳【关键词】杀伤细胞 ,天然 ;,骨髓移植 ;,移植物抗宿主病 ;,造血重建EffectofNKcellonGVHDandhematopoieticreconstitutionafterH2haploidenticalbonemarrowtransplantationinmice【Abstract】AIM:Toexploretheeffectofnaturalkiller(NK)cellongraftversushostdisease(GVHD)andhematopoieticreconstitutiona

2、fterH2haploidenticalbonemarrowtransplantationinmice.METHODS:MurinemodelofH2haplotypemismatchedbonemarrowtransplantationwasestablishedbyusingBalb/c(H2d)mouseasrecipient,andBalb/c(H2d)× C57BL/6(H2b)(H2d/b)mouseasdonor.LethallyirradiatedBalb/c(H2d)miceweretransplantedwithBalb/c(H2d)× C57BL/6(

3、H2b)(H2d/b)bonemarrowpluswithdonorperipheralTcellsand/orNKcells.GVHDandhematopoieticreconstitutionwereobservedandevaluatedbyclinicalmanifestations,pathologicalchangesandWBCcounting.RESULTS:InthebonemarrowpluswithTcellsgroup,GVHDwasinducedin90%miceandtherecoveryoftheWBCneeded4weeksaveragely;butintheg

4、rouppluswithlowconcentrationofNKcells,GVHDwasinducedin20%miceandtherecoveryoftheWBCwas3weeksaveragely;andinthegrouptransplantedwithhighconcentrationofNKcells,GVHDwasinducedonlyin10%miceandtherecoveryoftheWBCwas3weeksaveragely.ComparedwiththegrouptransplantedonlywithTcells,theincidencesofGVHDinthelat

5、ertwogroupsdecreasedobviously(P0.01),andtherecoveryoftheWBCwasinashortertime(P0.01).CONCLUSION:InmouseH2haploidenticalbonemarrowtransplantation,alloreactiveNKcellscanreducetheincidenceofGVHDandpromotehematopoieticreconstitution.【Keywords】killercell,natural;bonemarrowtransplantation;graftversushostdi

6、sease;hematopoieticreconstitution【摘要】目的 :研究自然杀伤 (NK)细胞在单倍体相合骨髓移植中对移植物抗宿主病 (GVHD)及造血重建的影响.方法 :以近交系Balb/c（ H2d）× C57BL/6（H2b）杂交 F1代小鼠（ H2d/b）为供鼠、 Balb/c（H2d）为受鼠,在移植物中增加供者的外周 T 细胞和 (或)NK 细胞进行半相合骨髓移植，根据临床表现、病理检查及外周血白细胞 (WBC)数,比较不同移植组GVHD 发生及造血重建情况 .结果 :骨髓 +T 细胞组中 90%的小鼠出现GVHD，外周血 WBC 平均在移植后 4wk 恢复正

7、常；而骨髓 +T+低浓度 NK 细胞组中 20%小鼠出现 GVHD,外周血 WBC平均在移植后 3wk 恢复正常；骨髓 +T+高浓度 NK 细胞组中仅 10%出现 GVHD，外周血 WBC也平均在移植后 3wk 恢复正常 .后两组较骨髓 +T细胞组 GVHD发生率显著下降 (P0.01),外周血 WBC 恢复时间显著提前 (P0.01).结论 :在小鼠单倍体相合骨髓移植中 ,同种反应性 NK 细胞可降低 GVHD 发生率 ,促进造血重建.【关键词】杀伤细胞 ,天然 ;骨髓移植 ;移植物抗宿主病 ;造血重建0 引言异基因造血干细胞移植(alloHSCT)是目前治愈恶性血液病的最有效手段.理想的供

8、者是人类白细胞抗原(HLA)相合的血源相关或无关供者,但前者的概率仅有 25%30%,后者的概率约为 1/10 万,故供者来源的严重不足是限制 alloHSCT的巨大障碍1.与 HLA 完全相合 HSCT比较 ,HLA单倍体相合移植难题之一是严重的移植物抗宿主病（GVHD）及移植后造血重建的延迟 .近年研究表明 ,NK 细胞能够通过直接和间接的方式调节造血功能，并通过特异性杀伤宿主的抗原提呈细胞（APC）,降低 GVHD发生率 2-3.本研究我们将供者NK 细胞作为预处理方案的组成部分,在 Balb/c（H2d）×C57BL/6（H2b）杂交 F1 代小鼠（H2d/b）移植给 Bal

9、b/c（H2d）小鼠模型上 ,观察移植前输注供者 NK 细胞对单倍体相合骨髓移植后 GVHD及造血重建的影响 ,借此评价其在单倍体相合 HSCT中的免疫调节作用 .1 材料和方法1.1 材料移植受鼠为 Balb/c(H2d)小鼠 ,雌性 ,810 周龄 ,体质量 1822g;移植供鼠为 Balb/c（H2d）×C57BL/6（H2b）杂交 F1 代小鼠（ H2d/b）,雄性 ,810 周龄 ,体质量 1822g.上述均购于第四军医大学实验动物中心.按移植物的不同分为 5 组,每组 10 只,所有受鼠均未给予 GVHD防治措施 . 单纯照射组 :照射后 4h 输注 RPMI1640液

10、0.2mL/只; 骨髓细胞组:照射后 4h 经尾静脉移植供鼠骨髓细胞 1×107/只; 骨髓 +T 细胞组 :照射后 4h 移植供鼠骨髓细胞1×107+T细胞 2×107/只; 骨髓 +T+低浓度NK细胞组 :照射后 1h 内移植供鼠 NK细胞 0.5 × 106/只,4h 后,移植供鼠骨髓细胞 1×107+T细胞 2×107/只; 骨髓 +T+高浓度 NK细胞组 :照射后 1h 内移植供鼠 NK 细胞 1×106/只,4h 后,移植供鼠骨髓细胞 1×107+T细胞2× 107/只.1.2 方法受鼠准备全

11、部受鼠在移植前 5d 开始饮用含庆大霉素 (32 万 U/L)+ 红霉素 (250mg/L)的灭菌水 ,移植前 4h 予 60Co射线全身照射 (TBI),总剂量 8.5Gy,剂量率0.5Gy/min.供鼠骨髓与脾细胞的制备颈椎脱臼法处死30 只H2d/b供鼠 ,无菌分离股骨、胫骨与脾脏.剪去股骨与胫骨的骨骺端,用RPMI1640 液反复冲洗骨髓腔， 0.83NH4Cl裂解红细胞后，用RPMI1640洗涤 2 次,调整细胞数为 1×108/mL备用 ;脾脏于 200 目筛网上研磨滤过收集脾单个核细胞悬液 ,用 0.83NH4Cl 裂解红细胞后 ,RPMI1640洗涤 2 次(作为 T

12、 细胞),调整细胞数为 1×108/mL备用 .供鼠 NK细胞的分离选择 H2d/b 小鼠脾细胞悬液为H2 单倍体相合NK细胞的来源 ,无菌条件下分离20 只 H2d/b 小鼠脾脏 ,用 200 目筛网研磨收集细胞悬液 ,400 目筛网过滤后制成脾单核细胞悬液,用 0.83NH4Cl 裂解红细胞 ,计数细胞数 ,调整细胞浓度为1× 107个细胞 /90 L缓冲液 (磷酸盐缓冲液 ,pH7.2),按每 107 个细胞加入 10L抗 NK细胞免疫磁珠(MiltenyiBiotec 公司产品 ),48孵育 15min 后，用 MiniMACS 分选仪(MiltenyiBiotec

13、 公司产品 )分选 NK 细胞 ,调整细胞数为5× 106/mL备用 .统计学处理：应用SPSS10.0统计包处理数据 ,多样本间均数比较用方差分析 ,率的比较用 2检验 .P0.05为差异有统计学意义 .2 结果2.1 临床及病理表现单纯照射组均无脱毛、弓背体位、腹泻等GVHD的临床表现 ,移植后精神萎靡 ,体质量逐渐减轻 ,全部在 2wk 内死亡 .肝、小肠和皮肤病理检查未见异常.骨髓细胞组移植后均无弓背体位、腹泻、脱毛等 GVHD的临床表现 ,移植后初期有精神不振、体质量减轻,但 2wk后逐渐恢复活泼好动的习性,体质量亦恢复正常 ,存活均超过60d.人为处死取其肝脏、小肠和皮肤进行病理检查,未见 GVHD病理改变 .骨髓 +T细胞组在移植后10d 开始出现典型少食、少动、体质量减轻、弓背体位、毛发紊乱无光泽和腹泻等急