Rab调节巨噬细胞Toll样受体信号转导通路的研究

1、摘 要Toll样受体家族可以识别几乎所有的病原微生物的一些结构组分和代谢产物，通过信号转导通路诱发细胞因子和趋化因子等启动机体的天然免疫，构成了机体抵抗病原微生物的第一道防线，在免疫学研究中一直是一个很受关注的家族。不同TLRs分子有不同的配体，如TLR3主要识别病毒dsRNA和Poly I:C；TLR4主要识别LPS等。TLRs的活化是一把双刃剑。一方面TLRs的活化在启动天然免疫应答和适应性免疫应答中发挥重要作用，另外一方面过渡活化或者活化异常可能引起急慢性疾病。因此TLR信号转导通路的负相调控成为天然免疫研究中的热点问题。曾有实验表明定位于溶酶体的Rab7b，能够通过转运TLR4受体到溶

2、酶体进行降解，从而负相调控TLR4的信号转导。而Rab7和Rab7b在分子水平上，有超过50的一致性和65的相似性，因此我们推测Rab7和Rab7b可能有相似的功能。目的：本实验通过建立稳定表达Rab7及其突变体的巨噬细胞系，分析稳定表达细胞系的生物学特性，研究Rab7及其突变体基因过表达后对LPS和Poly I:C刺激的巨噬细胞表达细胞因子的影响。方法：将Rab7及其突变体Rab7(T22N)的真核表达载体通过脂质体法转染RAW264.7细胞，G418选择性培养基筛选，建立稳定表达Rab7及Rab7T22N的细胞系。通过RT-PCR和Western Blot方法鉴定稳定表达细胞系。通过观察细

3、胞形态及MTT法分析稳定表达细胞系的生长特性。以LPS和Poly I:C刺激稳定表达细胞系不同时间后检测细胞因子的表达量变化。结果：与转染空质粒的细胞相比，转染Rab7和Rab7T22N的细胞中Rab7的mRNA和蛋白水平都显著增高。Rab7过表达后引起细胞形态变化并显著抑制了细胞增殖，Rab7T22N过表达后促进细胞增殖。Rab7过表达后，巨噬细胞在LPS和Poly I:C刺激后分泌的细胞因子显著降低，而Rab7T22N过表达后其的分泌又恢复。结论：成功建立了稳定表达Rab7及其突变体的细胞系。Rab7过表达后抑制了细胞增殖，负向调控了TLR信号通路。该研究为进一步阐明Rab7在TLRs信号

4、通路中的作用奠定了基础。关键字：TLR3；TLR4；Poly I:C；LPS，Rab7Research of Rab7 negative regulation of TLR3/4 pathwayResearch on the negative regulation of Rab7 on the the TLR3/4 signaling pathway in macrophages AbstractToll-like receptor(TLR) family can identify almost all s some of the structural components and metab

5、olites, induced cytokines and chemokines start the body's natural immunity through the signal transduction pathways,The recoganition of the structural components and metabolites of pathogenic microorganism by Toll-like receptor can iniatiate innate immunity by promoting the production of cytokin

6、es and chemokines, and thus constitue the first line of defence to pathogenic microorganism. constitute the first line of defense of a body to resist pathogenic micro-organismsSince the Toll like receptor iniated , in immunological research has been a popular concern in the familyStudy on the Toll l

7、ike receptor has been a a popular concern in immunological research.However, different TLRs have different ligandligands, such as TLR3 primarily identify viral dsRNA and Poly I:C,TLR4 major recognition LPSand LPS is the ligand for TLR4. .However, the activation of TLR is a double edged sword.on the

8、one hand,On one hand activat TLRs in innate immune responses and adaptive immune responses play an important roleActivation of TLRs play a vital role in the innate and adaptive immune responses, on the other hand, the activation transition and activation anomalism may cause acute and chronic disease

9、s.Overreaction of the signaling of TLRs has reported to be associated with acute and chronic diseases Therefore，negative regulation on the TLR signaling pathway bacome a hot issue .Reports have shown that lysosme-associated Rab7b negatively regulate TLR4 signal transduction by promoting lososomal de

10、gradation of TLR4. Since Rab7 and Rab7b have more than 50% identity and 65% similarity at the molecular level, we ddeduce that Rab7 and Rab7b may have similar functions.Objective: To establish and analyze the biological characteristics of transformed macrophage cell lines stably expressing Rab7and i

11、ts dominant negative mutant Rab7T22N, and study the production of cytokines in transformed macrophage cell lines after stimulation with LPS and Poly I: C. Methods: the eukaryotic expression Vector of Rab7 and Rab7T22N were transfected into RAW264.7 cells by liposome, and screened with G418.The G418-

12、resistant colonies were obtained and amplified. The transformed cell lines were identified by RT-PCR, Real-Time PCR and Western Blot. The characteristics of transformed cell lines were analyzed by observing the cell morphology and MTT methods. The production of cytokines were measured after transfor

13、med cell lines stimulation with LPS and Poly I:C. Results: Compared with the control group, the mRNA and protein expression of Rab7 were significantly improved in cell lines transfected with Rab7 and Rab7T22N. Overexpression of Rab7 changed the cell morphology and inhibited the proliferation of Raw2

14、64.7 cells, while overexpression of Rab7T22N promoted the proliferation of Raw264.7 cells. Overexpression of Rab7 significantly inhibited cytokines production in LPS and poly I:C stimulated macrophages. The production of cytokines were restored in Rab7T22N cell line. Conclusion: Overexpression of Ra

15、b7 inhibits the proliferation of macrophages, and suppresses the production of cytokines in macrophages stimulated with LPS and Poly I: C. The study may lay a foundation for our further study the role of Rab7 in TLRs signaling pathways.Key words: TLR3；TLR4；Poly I:C；LPS；Rab7Directed by: Prof. Wang yu

16、 zhenApplicant for Master degree: Wang Ning Fei （Agricultural Mechanization ?Biochemistry and Molecular Biology)(College of Life Sciences. Inner Mongolia Agricultural University. Hohhot 010018. China)目 录1引言11.1 Toll家族背景介绍11.1.1 TLR信号转导11.1.2 TLR信号与肿瘤的关系21.1.3 TLR3、TLR4简介及关联2 TLR3、4配体介绍31.2 Rab家族背景介绍

17、41.2.1 Rab5、7、9的简介51.3 研究意义61.3.1 Poly I:C/TLR3信号通路过渡活化61.3.2 LPS/TLR4信号通路过渡活化71.3.3 研究目的7第一部分 Rab7蛋白表达91 材料91.1 实验材料及试剂91.2 仪器91.3 试剂配置91.4 引物102 实验方法102.1 小鼠巨噬细胞株RAW 264.7的培养102.2细胞总RNA的提取及反转录102.3 cDNA的制备112.4 PCR反应体系112.5 LPS和poly I:C刺激后Rab5a、Rab7、Rab9的mRNA水平表达时效关系研究123 结果分析123.1 RAW 264.7细胞的培养及

18、刺激123.2 LPS刺激RAW 264.7细胞后Rab5a、Rab7、Rab9的mRNA水平表达时-效关系研究133.3 Poly I:C刺激RAW 264.7细胞后Rab5a、Rab7、Rab9的mRNA水平表达时-效关系研究143.4 LPS和Poly I:C刺激后RTQ-PCR检测Rab7的mRNA水平表达时效关系研究154 讨论16第二部分 Rab7调节巨噬细胞Toll样受体信号转导通路的研究181 材料与方法181.1 细胞株和主要试剂181.2试剂配置18配制聚丙烯酰电泳的试剂181.2.2 转膜的试剂191.3引物191.4 实验步骤191.4.1 RAW264.7巨噬细胞的培

19、养191.4.2 细胞计数201.4.3 突变载体的构建201.4.4 细胞转染201.4.5 蛋白提取201.4.6 BCA检测检测蛋白浓度211.4.7 SDS-PAGE211.4.8 Western blotting211.4.9 NO、iNOS含量测定23MTT法测基因转染对RAW264.7细胞的影响232 结果分析232.1 Rab7突变体稳定表达的细胞株的鉴定232.2稳定转染细胞RAW264.7生长形态242.3Rab7抑制Poly I:C诱导的巨噬细胞中TNF-、IL-1的表达262.4Rab7抑制Poly I:C诱导的巨噬细胞中IP-10、IFN-的表达282.5 Rab7抑

20、制Poly I:C诱导的巨噬细胞中NO/iNOs的表达292.6Rab7抑制LPS诱导的巨噬细胞中IP-10、IFN-的表达312.7 Rab7在LPS介导的TLR4通路中的作用333.讨论344展望35致 谢37参 考 文 献38作 者 简 介44缩 略 语 表TLRs(Toll-like receptors) Toll样受体PPR (Pattern Recognition Receptors) 模式识别受体IRAKs (IL-1 Receptor-associated Kinases) IL-1R相关蛋白激酶ERK（extracelluar signal-regulated kinases

21、） 细胞外调节蛋白激酶JNK(c-Jun-NH2-terminal kinases) c-Jun氨基末端激酶IP-10（IFN-inducible protein 10） 人干扰素诱导蛋白10GARG16（glucocorticoid attenuated response gene 16） 皮质激素削弱反应基因-16IRG1（IFN-regulated gene 1） INF调节基因 3IL-1(interleukin-1) 白细胞介素1polyI:C (polvriboinsine-polyribocyaidylic acid ) 聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸LPS（lipopolysa

22、eeharide） 脂多糖Rabs（Ras related proteins in brain） Rab蛋白PKC-(protein kinase ） 蛋白激酶CIFN-（interferon） 干扰素IL（intierleukin） 白细胞介素ORP1L（Oxysterol-binding protein-related protein 1L） 氧固醇结合蛋白相关蛋白1LEGFR （epidermal growth factor receptor） 表皮生长因子iNOS (inducible nitric oxide synthase) 诱导型一氧化氮合酶1引言1.1 Toll家族背景介绍T

23、oll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类重要的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PPR），主要是通过识别病原微生物的病原体相关的分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），广泛表达于单核细胞、活化树突状细胞、T、B淋巴细胞和NK细胞等多种免疫细胞中，产生趋化因子和细胞因子，启动天然免疫应答，构成了机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。TLRs是型跨膜蛋白，属于TIR（Toll/interlukin-1(IL-1)receptor）超家族。在结构上一般分为跨膜区、胞浆

24、区和胞外区三部分，共同的结构特征为胞外部分即富含亮氨酸重复序列（LRRs）。迄今为止已在哺乳类动物中发现TLR家族有13个成员，其中TLR1-9在人类和鼠类是相同的，TLR10是人类为特有的，而TLR11-13是鼠类特有的1。 TLR信号转导 Toll样受体可识别几乎所有病原生物的一些结构组份和代谢产物，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌、螺旋体等2,3。不同TLRs之间的胞外区同源性较差4，因而不同TLRs分子有不同的配体，且有些Toll样受体则需通过协同作用，识别不同病原体的特异的PAMPs组合体，而另一些Toll样受体还可以识别不止一种PAMP。TLR1主要在中性粒细胞、单核细胞、B细

25、胞、自然杀伤细胞(即NK细胞)上表达，识别膜孔蛋白、糖脂、PGN和非典型LPS等5；TLR2在中性粒细胞、单核细胞以及树突状细胞大量表达，可识别大部分现己发现的PAMPs结构，如分枝杆菌和疏密螺旋体的脂蛋白、G+菌的PGN、酵母菌和支原体的某些成分等6,7；TLR3主要表达在树突状细胞、巨噬细胞上，识别病毒复制时生成的dsRNA和聚肌胞苷酸Poly I:C8；TLR4主要表达在巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞以及树突状细胞上，主要识别脂多糖及具有保守类脂A结构的衍生物9，还能识别活结核杆菌的某些成分10；TLR5主要表达于树突状细胞、巨噬细胞上，识别细菌鞭毛蛋白11；TLR6主要识别细菌的肽聚糖

26、12；TLR7，8识别抗病毒化合物，许多情况下识别相同配体ssRNA13；TLR9可以通过同源二聚体的形式识别非甲基化CpG DNA 14。另外，TLR2能与TLR1和TLR6形成复合受体识别一些微生物成分15。而近年发现的TLR11主要参与识别尿路致病性大肠杆菌中某种成分和Profilin样分子16目前，己发现有五个接头蛋白参与Toll样受体信号途径，MyD88、TRIF、TIRAP、SARM和TRAM。其中MyD88能被所有Toll样受体招募；TRIF能被TLR3和TLR4招募；TIRAP能被TLR2和TLR4招募；而TRAM只能被TLR4招募。本文主要研究的是MyD88依赖和非依赖两条胞

27、内信号转导途径。MyD88是一个连接蛋白，它的作用主要是连接IL-1R与IL-1R相关蛋白激酶(IRAKs）的。当配体与IL-1R结合之后，将IRAK磷酸化，使其从受体复合物上脱落，随后TRAF6促进了MAPK激酶ERK(extracellua rsignal-regulated kinases)、JNK(c-Jun-NH2-terminal kinases)和P38磷酸化以及I-B和I-B的降解，使转录因子调控AP-1和NF-B活化和趋化因子(CXC趋化因子MIP-2和KC，以及CC趋化因子MIP-1和JE/MCP-1) ，细胞因子(TNF-a，IL-6，IL-1和IL-12)的表达。MyD

28、88非依赖性途径中的一些成分已经被弄清楚了，这些基因包括IFN-、IP-10（IFN-inducible protein 10）、CXC趋化因子家族、GARG16（glucocorticoid attenuated response gene 16）、IRG1（IFN-regulated gene 1）。总体来说TLRs信号通路在抗感染中发挥的生物学效应主要有三个方面：一是激活NF-B和IRF等转录因子，导致大量促炎症性细胞因子和趋化因子产生，这些促炎症性细胞因子和趋化因子能招募粒细胞，单核细胞， NK细胞等，从而启动并放大炎症反应；二是通过接头蛋白参与介导的凋亡信号通路诱导被感染细胞的凋亡，

29、下调感染反应性，减轻组织损伤17；三是介导释放抗炎因子如IL-4、IL-10，IL-12等，负调机体的过强应答，避免自身免疫的发生18。 TLR信号与肿瘤的关系己经有研究表明，TLR与多种疾病有着密切关系，如真菌感染、肿瘤、脓毒症、皮肤病、动脉粥样硬化、肝脏疾病以及胃肠道疾病有着密切关系。近年来发现，TLRs除了识别病原体的保守结构，也可以识别在损伤、应激和细胞非凋亡性死亡等情况下机体内产生的一些内源性分子，越来越多的研究证明热休克蛋白(heat shock portein，HSP)就是TRL的内源性配体。 TLR3、TLR4简介及关联Toll家族中的TLR3广泛表达在各种组织和细胞，主要表达

30、于脑、心脏、肺、胎盘、肌肉、胰腺细胞中19，而在人胎盘组织表达最高20。，TLR3可识别HBV、HCV病毒中的dsRNA，最早研究报道其主要是通过MyD88非依赖性信号转导通路将信号传递到细胞内，通过诱导IFN-含TIR的结构域(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-，TRIF)传递信号21，合成并释放一系列的细胞因子和炎性介质，引起干扰素等抗病毒蛋白的激活，发挥其抗病毒作用，抑制受感染细胞增殖并诱导其凋亡22,23。 在TLR3信号中有一个种现象：耐受现象。有实验采用剂量递增连续染毒法评价Poly I:C的蓄积毒性，实验结果显示：对实验组小鼠进

31、行剂量递增法连续注入Poly I:C后未发现有明显的Poly I:C毒性反应，没有小鼠死亡，与对照组小鼠的体重相比实验组小鼠体重无显著差异。剂量的耐受实验，表明实验组小鼠无死亡现象，而且与对照组相比差异不显著，提示实验组小鼠对Poly I:C注射液产生了一定程度的耐受性24。人TLR4是最早被发现的哺乳动物Toll样受体25。TLR4分布广泛，除白细胞、淋巴组织、树突状细胞及单核巨噬细胞外，还分布于表皮微血管、小肠上皮细胞和人齿跟纤维母细胞、脐静脉的内皮细胞、小鼠脂肪细胞、人子宫颈平滑肌细胞、大鼠心肌细胞及脑组织(脉络丛、软脑膜、正中隆突等)，以及多种肿瘤细胞膜表面。在损伤和炎症过程中TLR4

32、的激活在周围微环境内发挥着重要作用，可通过MyD88依赖和非依赖两条胞内信号转导途径激活炎性细胞，合成并释放一系列的炎性介质和细胞因子，进一步诱发机体的特异性免疫反应。业已证明，TLR4在活化后被转运到溶酶体进行降解46。在TLR4信号中也有耐受现象：内毒素耐受。有实验表明先用小剂量内毒素或其同系物刺激DC或单核巨噬细胞，随后再用致死剂量冲击，发现细胞因子的释放量大幅度减少甚至不分泌，以保护机体不受内毒素致死性毒性攻击，这种现象被称为“LPS耐受”26。小剂量内毒素刺激即可诱导内毒素耐受。根据诱导剂量、间隔时间、次数等的不同，分别产生早期耐受和晚期耐受。一般内毒素耐受为早期耐受。内毒素耐受同细

33、胞膜TLR4-MD2复合物的形成下调密切相关27。有研究表明因为TLR3与特异性配体结合后，可通过MyD88依赖或非依赖的信号通路，激活细胞的胞内信号传导通路。两种信号通路最终导致各种促炎症细胞因子( IL-1、IL-6、IFN-、和TNF-)和化学增活素(IP-10)等的合成与释放，与此同时会上调TLR4，形成正反馈28。 TLR3、4配体介绍聚肌胞(polvriboinsine-polyribocyaidylic acid，Poly I:C) 又名聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸或聚肌胞苷酸，是人造dsRNA，常作为型干扰素诱导剂29，可被TLR3识别。Poly I:C是一种高效干扰素诱导剂，用于增强

34、巨噬细胞吞噬作用、激活T细胞，提高机体免疫力30，国内外广泛应用于调节免疫、抗病毒和前列腺癌辅助治疗31。有实验表明Poly I:C可以明显降低移植肿瘤的生长速度，降低荷瘤小鼠的死亡率和体内转移发生率32。Poly I:C诱导的TLR3的早期活化及后续产生的IFN/有助于建立局部的抗病毒状态，限制病毒在感染部位复制。在免疫学研究中也常用来Poly I:C模拟RNA病毒感染及病毒致病机制的相关研究。内毒素(endotoxin)，是革兰阴性菌及其它一些微生物(立克次体，衣原体等)细胞壁外膜中的重要组成部分，其化学本质为脂多糖(lipopolysaeeharide，LPS)，可被TLR4识别。它在革

35、兰阴性菌感染的致病机理中起着十分重要的作用，它不仅是决定革兰氏阴性细菌感染(如感染性休克和脓毒血症)的主要致病分子，而且与人类其他许多疾病关系密切，是一种危及人类健康乃至生命的最为重要的病原菌相关模式分子(PAMP)33。1.2 Rab家族背景介绍Rabs（Ras related proteins in brain）蛋白，属于Ras超家族，Rab基因编码的蛋白质主要以单体形式存在，一般由200210个氨基酸组成，分子量多数为2227kD，由高度保守的GTP/GDP结合的结构域和可变的N端与C端组成。Rab家族成员的氨基酸序列的相似性大约在35 %80 %之间，极少数大于80%。Rab基因普遍存

36、在于果蝇、拟南芥、酵母和人等真核生物中，不同生物类群的Rab亚家族的成员数量各不相同。如裂殖酵母Rab基因种类较少，仅编码7个Rab蛋白，芽殖酵母编码11个Rab蛋白，拟南芥中已经分别发现了57种，而人中则编码了有60多种Rab蛋白。在海洋生物中，仅在日本对虾、紫色球海胆等少数物种中有零星的Rab基因研究。大多数Rab蛋白没有组织特异性，而Rab蛋白高度可变的C末端决定着Rab蛋白亚家族成员与细胞器膜的结合位置，所以Rab蛋白分布在细胞内的不同膜区室，参与调节细胞内所有的膜运输过程34。Rab蛋白能够在GDP结合的非活性形式和GTP结合的活性形式之间转换，调控着囊泡转运的的各个环节，如囊泡的形

37、成、转运、锚着以及融合过程。Rab蛋白家族的不同成员高度局限性地定位在各种囊泡的膜表面，可以用来对特定的转运途径进行描述36。例如：Rab1b，Rab2，Rab6，Rab11主要参与了细胞的调节和外排作用，Rab1，Rab2，Rab6与内质网和高尔基体之间的转运有关，Rab11调节从高尔基体到质膜的转运。Rab4，Rab537,38，Rab739，Rab11是细胞内吞和囊泡转运过程中的主要调节蛋白，Rab5则调节了笼形蛋白衣被小泡在质膜和早期内吞体之间的转运，Rab740与晚期内吞体的形成和转运密切相关，Rab3，Rab8b，Rab26，Rab37则与分泌颗粒的转运和突触小泡相关，而Rab4，

38、Rab11均参与了早期内吞体和晚期内吞体返回细胞膜的转运。因此，细胞外的因素便可以通过改变Rab蛋白与其效应分子的活性状态来调控囊泡转运，如Fiory报道蛋白激酶C（PKC-）通过对Rab5和PI3K的影响调节胰岛素内化41。因此理论上Rab蛋白与内源抗原递呈囊泡的转运相关，从而成为免疫系统调节抗原提呈的环节之一。近年来，越来越多的研究表明，Rabs蛋白除了参与调节囊泡的转运外，还广泛地参与了信号转导过程。如Rab5和Rab7可与交叉提呈的MHC I类分子肽复合物共聚。 还有研究表明，Rab5参与表皮生长因子（EGFR）的信号转导，而过表达失活突变的Rab5:S34N阻断了EGFR活化引起的R

39、af-ERK1/2信号通路以及细胞的增殖42。Rab7定位于晚期内体/溶酶体结构，除了调控内吞过程的晚期运输外，还参与转运受体，如血管紧张素受体1A43、EGFR44、神经生长因子受体TrKA 45到溶酶体的降解，而受体所在的位置和转归决定着信号输出的结果。 Rab5、7、9的简介Rab5a蛋白主要存在于质膜、网格蛋白覆盖的囊泡和早期内体上，它主要负责调控胞吞过程中早期内体(early endosome)与胞吞泡的融合，是早期胞吞途径中一个重要的限速成分。随着对Rab5a结构与功能的深入研究，越来越多的证据表明Rab5a不但参与细胞内物质运输、蛋白质分选，而且还与信号转导、细胞骨架重建和受体下

40、调等功能密切相关47。Rab7在不同细胞中的表达水平存在差异，可能与细胞的内吞活性有关。Rab7在早期内体到晚期内体以及晚期内体到溶酶体的膜泡运输中起重要作用。但Rab7在这两个途径中的效应分子不同，从早期胞内体到晚期胞内体的膜泡运输中需要Rabring7和RILP（Rab7-interacting lysosomal protein），Rab7募集相关的溶酶体蛋白RILP和氧固醇结合蛋白相关蛋白1L (Oxysterol-binding protein-related protein 1L，ORP1L)，然后共同募集和活化马达分子动力蛋白，从而驱使晚期内体转运到微管负末端，最后调节晚期内体向

41、液泡/溶酶体的转运。从晚期内体到溶酶体的膜泡运输过程中Rab7的效应分子是SAND-148。甲状腺激素的产生和胆固醇水平的调节也与Rab7基因有关。Rab9也是Rab蛋白家族成员之一，属于小GTP酶。Rab9主要定位于晚期内体，与甘露糖6-磷酸受体（MPR)从晚期内体到反式高尔基网络的转运相关联。Rab9 GTPase和其效应蛋白TIP47粘合可增强TIP47和MPR胞浆区域的相互作用。1.3 研究意义在第一部分的介绍可知TLRs可诱导天然免疫应答维护机体，但TLRs的活化是一把双刃剑。TLRs诱导的天然免疫应答在抵抗和清除微生物感染、维持机体免疫系统的稳态方面发挥了重要作用，甚至可以促进肿瘤

42、细胞上调表达以产生有效的细胞免疫应答。然而，TLRs的过渡活化或者活化异常可能引起急性和慢性疾病，而且还可以保护肿瘤细胞使其逃避免疫监视。近期研究还证实TLRs在机体损伤及免疫逃避、类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病、动脉粥样硬化形成、移植排斥反应等多种疾病的发生发展中有重要作用。 Poly I:C/TLR3信号通路过渡活化Poly I:C既可以诱生干扰素诱导细胞凋亡而杀灭肿瘤细胞，还可能通过提高机体的体液免疫和细胞免疫功能来增强免疫效应。如Poly I:C可能通过对TLR3的早期活化，来抑制hMPV在小鼠肺内的复制，从而减轻肺部炎症。但是在利用Poly I:C诱生干扰素时由于种类和个体差异会导致

43、毒性的产生，如对小鼠ICR-JCL小鼠进行尾静脉和腹腔注射Poly I:C注射液(1mg/mL)。小鼠会急性死亡，其过程表现为：先萎靡迟钝和畏冷，之后便开始体温下降、呼吸困难，其鼻粘膜、口腔和四肢发绀，并有腹泻的症状。静脉注射死亡多在3-6h，腹腔注射一般需要6-8h50。而在人医临床较大剂量(大于1mg/kg)应用时，病人通常会表现出流感症状51，其中发热是最为典型的症状，同时也可能诱导产生一些自身免疫疾病52。另外有实验表明：Poly I:C在引起小鼠产生自身抗体的同时也可能导致肝组织损伤，有引发自身免疫性肝病的趋势。自身免疫性肝病主要包括:自身免疫性肝炎(autoimmune hepat

44、itis，AIH)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)和原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)。它们血清中均出现不同程度的自身的抗体升高和肝脏炎性浸润，但自身抗体的类型和肝脏损伤的部位及程度均有所不同53。除此之外，TLR3还可以通过引起组织损伤促进病毒扩散。Martha HatchenS54等研究发现，给围产期内的TLR3缺陷鼠和野生型小鼠分别接种牛痘病毒，与野生型小鼠相比，TLR3缺陷鼠中病毒复制量明显减少，病毒扩散速度明显减慢，存活率也增高，肺炎患病率明显下降，此实验提示TLR3在牛痘感染

45、中可能引起了不良的免疫反应，导致患者发病率和死亡率上升。Diamond和Klein等有报道，TLR3在血脑屏障内皮细胞上有高表达，west Nile病毒感染后，dsRNA通过与TLR3作用导致内皮细胞死亡，破坏了血脑屏障，从而促使病毒加速进入中枢神经系统，导致宿主的病情加重，而与野生型小鼠相比，TLR3缺陷鼠外周血中病毒复制较快，炎症反应较强，但在中枢神经系统中病毒颗粒显著减少，病理改变明显减弱。通过Hepatotropic PuntaToro Virus感染TLR3缺陷型鼠和野生型鼠的研究发现，TLR3缺陷型鼠的肝炎发病率明显下降55。以上实验结果表明TLR3通过引起组织损伤促进了病毒的扩散

46、。TLR3介导的促病毒扩散可能与TLR3诱导的组织损伤有关。除正常细胞外，TLR3也可诱导肿瘤细胞的凋亡56。 以上例子表明TLR3对于病毒感染的作用除了可以通过天然性和获得性免疫抑制病毒的复制、促进病毒的清除；还可以介导的组织细胞的损伤，从而介导病毒的扩散。 LPS/TLR4信号通路过渡活化LPS可通过TLR4介导细胞，特别是单核巨噬细胞，合成并释放各种细胞因子，再通过旁分泌或体循环作用于其他组织细胞，引起全身炎症反应综合征(SIRS)，严重者导致多器官功能衰竭、休克和死亡。然而，近年来越来越多的研究表明，除了髓样细胞发挥作用外，内皮细胞在LPS引起的内毒素休克和多器官功能衰竭等病理过程中也

47、起着重要的作用57。虽然对LPS的确切作用现在仍有争论，但它在启动机体免疫反应，导致中毒性休克中的重要性己得到了普遍的认识。 研究目的因此，如何负相调控TLR信号转导通路成为天然免疫研究中的热点问题。鉴于负相调控网络的复杂性，发现新的抑制性分子不仅有助于加深理解TLR的信号转导机制，而且能为药物治疗炎症性疾病提供新的靶点。有研究结果表明，Rab7的同源分子Rab7定位于溶酶体，能够将TLR4受体转运到溶酶体进行降解，从而负相调控TLR4的信号转导16。鉴于Rab7和Rab7b在分子水平上，有超过50的一致性和65的相似性，因此我们推测Rab7和Rab7b可能有相似的功能。而从Rab蛋白研究发展

48、角度上说，目前约有40个Rab蛋白被发现，它们定位在胞内各个细胞器，调节蛋白转运的各个环节。但通过人类基因组测序分析发现大约有60多个Rab蛋白的EST，因此对Rab蛋白的研究任重而道远。同时对Rab蛋白的深入研究有助于细胞膜内外，胞浆中各个细胞器之间及胞浆胞核之间蛋白转运机制体系的进一步完善，并为临床上由于蛋白转运异常而引起的疾病提供新的思路和方法。本课题拟采用小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7作为细胞模型，研究Rab7在TLR3配体poly I:C和TLR4配体LPS刺激下的表达模式；采用多种方法和手段研究Rab7对TLR3、TLR4信号转导的影响，在此基础上进一步探讨其发挥作用的机制。

49、本项目的完成有助于深入理解天然免疫应答的调控机制，为寻找感染性疾病治疗的靶标提供科学的依据。第一部分 Rab7蛋白表达大多数Rab蛋白在哺乳动物细胞中组成性表达。但是一些Rab蛋白的表达水平会受到炎性刺激或疾病的影响。如cAMP能促进Rab5a和Rab7的表达；同样在巨噬细胞中IFN-能增强Rab5a的表达水平；病原虫T.cruzi感染心肌细胞后，Rab7和Rab11表达下调58。可见Rab蛋白参与了病毒或外源物参与的信号转导。LPS和poly I:C是否也对Rab5a、Rab7和Rab9的表达有影响，至今没有研究报道，但之前有研究表明，定位于溶酶体Rab7b的表达能够受LPS和Poly I:

50、C刺激影响，并且将TLR4受体转运到溶酶体进行降解，从而负相调控TLR4的信号转导59 。Rab7是Rab7b的同源分子，鉴于Rab7和Rab7b在分子水平上，有超过50的一致性和65的相似性，因此我们推测Rab7和Rab7b可能有相似的功能。据报道Rab5和Rab7与交叉递呈囊泡的MHC-I类分子复合物共聚。而Rab9参与甘露糖6-磷酸受体从晚期内体到反式高尔基网络的转运，从而考虑是否Rab5和Rab9可能也参与了LPS/TLR4和Poly I:C/TLR3信号转导途径。我们希望通过本实验研究一下在Poly I:C和LPS诱导TLR3/4信号通路时是否会影响Rab5a、Rab7和Rab9的表

51、达。1 材料1.1 实验材料及试剂小鼠巨噬细胞RAW 264.7、胎牛血清（购自北京协和细胞库），DMEM培养基、LPS、poly I:C（均为美国Sigma公司产品），RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Taq酶，（均为宝生物公司产品）real time mix（康为世纪）。1.2 仪器CO2培养箱（310576-2601，Thermo），酶标仪（MULTISKAN MK3，Thermo），超净台（SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司）， 梯度PCR仪(BIO-RAD，美国) ，低温离心机（CT15RT，Versatile Refrigerated Centrifuge），电泳仪全自动凝

52、胶成像系统，ABI 7300 (Applied Biosystems，USA)。1.3 试剂配置(1)PBS NaCl 8.0gKCL 0.2gNaHPO4 1.15gKH2PO4 0.2gPH值为7.8，并定容到1L。(2)冻存液：20% 的血清；70% DMEM；10% DMSO(3)TAE Tris酸 24.2g冰乙酸 5.71mlEDTAH2O 3.72g并定容到1L。1.4 引物表1 引物序列名称序列长度Rab5a-senceRab5a-anitsenceRab7-senceRab7-antisenceRab9-senceRab9-antisence5-GGA GCA ACA AGA

53、 CCC AAC G- 35-AGG ACT TGC TGG CCT TGG A- 35-CAC TTT CAA AAC CCT CG- 35-TTC TTG GCA CTG GTC TCG-35-CTT GGA GAT GGT GGA GTT G- 35-AGT CGC CGT TGT CCT TGC - 3359bp324bp405bp2 实验方法2.1 小鼠巨噬细胞株RAW 264.7的培养(1)将在液氮中保存的RAW 264.7细胞株在37水浴锅中解冻；(2)1500rpm离心5min后，弃上清；(3)混悬沉淀细胞，后接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中；(4)置37，5% CO2

54、培养箱培养，1-2d换液或传代一次。2.2细胞总RNA的提取及反转录按Trizol试剂说明进行。(1)贴壁细胞用PBS洗2次，按1×107细胞加入1 ml细胞总RNA抽提试剂Trizol，充分匀浆，室温放置5min；(2) 加入0.2 ml氯仿上下颠倒充分混匀，室温静置5min；(3)12000g，4°C离心15分钟；(4)从离心机中取出离心管，此时匀浆液分三层，取无色上清层；(5)加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟；(6)4°C、12.000 g离心15分钟；(7)弃上清，沉淀以75 %乙醇洗涤；(8)4°C、7.500 g离心5分钟后，空气干燥；(

55、9)溶解于40 ml DEPC处理的水溶液，进行浓度和纯度测定后保存于80°C。 2.3 cDNA的制备表2 反转录反应体系试剂体积5×PrimeScript TM BufferPrimeScript TM Buffer RT Enzyme MixOligodT PrimerRandon 6 mersTotal RNA2µl0.5µl0.5µl0.5µl1µg加RNase Free dH2O到10µl体系，42°C ，15min；85°C 。2.4 PCR反应体系 Rab5a的反应参数： 98°C 10min94°C 30s 47°C 30s 30cycles72°C 30s 72°C 10minRab7的反应参数： 98°C 10min94