第三讲 高效液相色谱的原理与构造

1、第三讲 高效液相色谱(HPLC)的原理与构造陆跃乐浙江工业大学 发酵工程研究所内容概要一、高效液相色谱简介二、高效液相色谱的固定相和流动相三、高效液相色谱分离公式与术语四、液相色谱仪的基本配置五、检测器的种类和用途六、色谱柱简介2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所2一、一、 什么是什么是HPLC？高效液相色谱： HPLC (High Performance Liquid Chromatography )是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效 能分离手段：高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵 敏度检测器广泛应用于各个领域: 医药，环保，石化，生命科学，食品，农业无论在技术上，理论上，

2、还是在应用上仍有较大的 发展空间: 超高压液相色谱(UPLC)的创立2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所3高效液相色谱的流程2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所4二、高效液二、高效液相色谱相色谱固定相和流动相固定相和流动相2.1固定相的种类：固定相的种类：1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小，柱

3、容量底；2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所5 （3）化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所6化学键合固定相的化学键合固定相的特点：特点：（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱； 存在着双重

4、分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主； 2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所7 2. 2.液液- -固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：510 m； 2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所83.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团） 树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2） 阴离子

5、交换树脂（强碱性、弱碱性）2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所9 4. 4. 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所102.2 液液相色谱的相色谱的流动相流动相 1. 流动相的特性 （1）

6、液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所112. 2. 流动相类别流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相

7、可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所123. 3. 流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所134. 4.

8、 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题2022-2-18（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。浙江工业大学 发酵工程研究所142.3 HPLC分类分类n按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(Normal Phase Chromatography) 固定相的极性大于流动相反相色谱(Re

9、versed Phase Chromatography) 固定相的极性小于流动相n有机化合物的极性：分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种描述。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所152.4 HPLC的基本类型：的基本类型：n等度： 吸光度相同； 在整个运行过程中溶剂组成保持不变 (60:40 甲醇/水)2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所16n梯度： 在运行过程中溶剂组成变化； 渐变或台阶式变化。 100% H20/ 0% MeOH 到0% H2O/100% MeOH2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所17三、三、HPLC分离公式与术语分

10、离公式与术语n色谱图：样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称 色谱流出曲线(elution profile)。n这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图，这张色谱图含有丰富的信息，现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所18n基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。n噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所19n漂移(drift)基线随时

11、间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。n色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所20n峰底基线上峰的起点至终点的距离。n峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。n峰宽(peak width，W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。n半峰宽

12、(peak width at half-height，Wh/2)峰高一半处的峰宽。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所21n峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的面积。洗脱体积(V)和峰宽(W):洗脱体积也可按保留时间表示，记作t。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所22分离度（R）：分离程度的度量n简单来说，分离度即为两峰相对于其峰宽分开得有多远。n分离度大于1.5视作完全分离。时间时间 0.5 1 2 5 2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所23保留因子（k）：保留能力的量度nk是样品与填料作用强度的直接量度。 0.5 1 2 52022-2-18浙

13、江工业大学 发酵工程研究所24分离因子（）：峰分离程度的量度n是两个化合物在同一套色谱系统上，保留差异的数值表述。 0.5 1 2 52022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所25理论塔板数（N）：分离效率的量度n理论塔板数或柱效是一个数值，它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度。W=0.5 W=2 t=52022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所26分离度方程式（R）：n分离度方程式描述了分离度与分离因子、柱效和保留因子之间的关系。n它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所272022-2-18浙江工业大学 发酵工程研

14、究所2800011/20.522/30.6733/40.751010/110.912020/210.952022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所29分离度方程：分离因子项n当值很小的时候，其很小的变化也可引起R值较大的变动；当值很大的时候，此项接近1。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所30分离度方程：柱效N项n分离度R与理论塔板数的平方根成正比2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所31色谱峰对称性的测量方法2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所32四、四、HPLC的构造的构造2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所332022-2-18浙江工业大学 发酵

15、工程研究所344.1 真空脱气机真空脱气机n系统中气泡的产生：流动相本身存在，梯度淋洗混合后放出气泡；n气泡的影响：存在于管路中，系统压力不稳定，实验结果有偏差；存在于单向阀中，易造成液体回流，流量不准确，甚至是 不吸液；存在于检测器中，出现鬼峰，影响检测准确性。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所35n如果所用泵在低压端进行溶剂混合（如 Agilent 1200 系列四元泵），则需要进行脱气，因此必须配备一台真空脱气机或其他脱气系统（如用氦气进行脱气）。n单元泵和高压混合泵则通常不需要进行脱气。但在下述情况下，对于等度洗脱或高压混合泵也建议使用真空脱气机：如果在低 UV 波长段、用

16、最高的灵敏度进行检测，如果分析要求使用最佳的进样精度，或如果分析要求保留时间重现性很高（在流速低于 0.5 ml/min 时必须使用）。如果样品或检测对流动相中溶解的氧敏感（降解）。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所36溶剂瓶中的溶剂在 LC 泵的抽取下流过真空箱内的特殊管状塑料膜。当溶剂经过真空管时，溶剂中溶解的气体将渗过塑料膜进入真空箱。当溶剂离开真空脱气机的出口时，几乎已被完全脱气。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所37nAgilent 1200 系列真空脱气机（G1322A 型）由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个真空泵构成。打开真空脱气机后，控制电路即

17、开启真空泵，真空泵运行使真空箱内产生部分真空。其压力由压力传感器测定。根据压力传感器的信号，真空脱气机通过打开或关闭真空泵来维持部分真空。4.2 四元泵四元泵n高压输液泵：最高压力可大400 bar；n四通道：方便使用，比如：A通道水，B通道乙腈，C通道甲醇，D通道临时流动相。n为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。n应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所38四元泵包括一个溶剂槽、一个真空脱气机和一个四通道梯度泵。四通道的梯度泵包括一个高速配量阀

18、和一个泵组件。它通过低压混合来产生梯度。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所39四元泵的液路图2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所404.3 自动进样器自动进样器2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所41n流路中为高压力工作状态；n通常使用耐高压的六通阀进样装置；n其结构如图所示：2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所424.4 手动进样器手动进样器nAgilent 1200 手动进样器使用Rheodyne 7725i （罗丹尼）七通进样阀。样品经阀前部的进样口打入外接于阀的20 l 样品环。 阀内有陶瓷固定片和Vespel 进样密封。当阀在进样和充样位置之

19、间来回切换时，固定片上的先合后开通路确保流量不被中断。n阀装在钢制固定杆上，并能装在LC 系统两侧。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所43n充样位置：在充样位置 ，泵直接和柱子联接( 孔2 和孔3 联接)，并且针口和样品环联接。至少2 到3 倍样品环体积的样品通过针口注入，以便达到好的精度。样品填入环内，过量的样品通过和孔6 联接的排放管排出。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所44n进样位置：在进样位置 ，泵和样品环联接( 孔1 和孔2 联接)。将全部样品从环冲洗到柱。针口和排泄管( 孔5) 联接。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所454.5 柱温箱柱温箱n

20、Agilent 1200 系列柱温箱是用于 LC 的叠放式温度控制柱温箱。它即可作为单独模块使用又可作为 Agilent 1200 系列系统的一部分使用。用它来加热和冷却色谱柱，以达到保留时间重现性的最高要求。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所46五、检测器五、检测器n样品在经过色谱柱分离后，各个组分先后进入到检测器中，由检测器进行检测。n对检测器的一般要求为：灵敏度高、重复性好、线性范围宽、死体积小、对温度和流量的变化不敏感。n高效液相色谱中，常用的检测器可分为两类：溶质性检测器：它仅对被分离组分的物理或物理化学特性 有响应。如紫外、荧光、电化学检测器等。总体检测器：它对试样和洗

21、脱液总的物理和化学性质响应， 如示差折光检测器等。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所47(1) 紫外检测器紫外检测器n作用原理：依据被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光率的关系遵守比尔定律。n比尔朗伯定律数学表达式A=lg(1/T)=KbcA为吸光度，T为透射比，是透射光强度比上入射光强度； K为摩尔吸收系数，它与吸收物质的性质及入射光的波长 有关，c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所48n紫外检测器的特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波

22、长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所49（2 2）光电二极管阵列检测器）光电二极管阵列检测器2022-2-18紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。浙江工业大学 发酵工程研究所502022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所51光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所52（3）示）示差折光差折光检测器检测器2022-2-18 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；浙江工业大学 发酵工程研究所53示差折光检测器示差折光检测器2022-2-18浙江工业大学 发酵工程研究所5