猪脾转移因子的制备及临床应用_乔宏兴_图文

1、猪脾转移因子的制备及临床应用乔宏兴 , 白静(郑州牧业工程高等专科学 校 , 河南郑州 450011摘要 :本试验采用透析法提取猪脾转移因子 (T F , 并对其理化性质 、 生物活性 、 安全性进行了研究 。 结果表明 , T F 可增 强 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能 , 体外抑菌结果 显示金黄色 葡萄球 菌 、 大 肠杆菌 、 沙 门氏菌 对转移因 子敏感 , 而 链球菌 不敏感 。 对猪流行性腹泻 、 猪传染性 胃肠炎分别使用 T F (0. 2、 0. 1、 0. 05mL /kg 和药物进行治疗 , 结果表明使用 0. 1mL /kg T F 的剂量 效果较好 。关键词 :转移因子

2、; 巨噬细胞 ; 抑菌中图分类号 :S852. 4 文献标识码 :A 文章编号 :1671-7236(2011 07-0203-03 转移因子 (transfer facto r , TF 是从致 敏淋巴 细胞中提取的一种可溶性不耐热的小分子肽 , 分子 质量为 35005000, 56 30min 可灭活 , 低温保存 数年活性不消失 。 具有传递特 异性细胞免疫 的作 用 , 还能非特异地增强 一般细胞免疫作用 (冯 来坤 等 , 1999 。 转移因子的作用发生迅速 , 维持时间也 较长 , 可达数月至一年以上 。 由于转移因子是小分 子成分 , 无抗原性 , 长期应用机体也不产生抗体

3、。 近 年来研究证明 , 转移因 子作用无种属特异 性 (蔡琳 昌 , 1990 , 生化指标 、 生物活性及临床效果均与人转 移因子相似 , 且无毒 , 不引起过敏反应 。 因此 , 可利 用猪脾制备 , 河南是养猪大省 , 每年屠宰数量巨大 , 所产生的猪的废弃物脾脏数量也很大 , 可以将猪的 脾脏变废为宝 , 提取生物制品 。 作者对猪脾转移因 子的制备 、 活性检测 、 免疫特性及在临床上的应用等 进行了研究 , 以供于兽医临床使用提供依据 。收稿日期 :2010-12-09作者简介 :乔宏兴 (1976- , 男 , 河 南人 , 讲师 , 硕士 , 研 究方向 :动物免疫学 、 预

4、防兽医学 。基金项目 :河南省教育厅项目 (2009A230006 。 1 材料与方法1. 1 材料 猪脾脏 , 由郑州肉联厂提供 ; 试剂 :双蒸 水 、 1%鸡红细胞 、 可溶性淀粉由郑州牧业工程高等 专科学校微生物教 研室提供 ; 仪器 :高 速组织捣碎 机 、 低温冰柜 、 离心机 、 透析袋 、 紫外分光光度计等 ; 试验动 物 :小 白鼠 , 购于 郑州大 学实 验动物 中心 。 猪 , 购于河南某猪场 。1. 2 方法1. 2. 1 透析法制备 将冻存的猪脾脏取出融化 , 去 脂肪 、 被膜 , 充分洗净 。 用组织捣碎机绞碎 , 加适量生 理盐水后 , 用高速组织捣碎机高速 (

5、12000r /min 匀浆 2次 , 每次 1min 。 将匀浆置 -20 反复冻融 3次 。 最后一次融化后以 3000r /min 离心 30min , 取上清 , 将上清置透析袋内 , 用无热原的冷生理盐水在 0 4 环境下透析过夜 , 收集袋外透析液即为制备的转 移因子 (张萍等 , 2007 。 -20 保存备用 。1. 2. 2 猪脾转移因子理化性质检验 按分光光度法 测定 , 在 (251±1 nm 处有最大吸收度 , 紫外光光度 计测定 260nm 与 280nm 比值 ; 取 2mL 加入适量茚 三酮溶液 , 加热后进行反应 。1. 2. 3 安全试验 取小白鼠

6、40只 , 分成 1、 2、 3、 4组 ,(1. Co llege of Animal Science and Veterinary M edicine , Qingdao Ag ricultural University , Qingdao 266109, China ;2. College of Haidu , Qingdao Ag ricultural University , Laiyang 265200, China ;3. Veterinary Station in Guandao Town , Qixia 265316, China A bstra ct :T he susce

7、ptibility test of F lorfenico l and O xytetracycline Hy drochloride o n six strains of Escherichia coli and Salmonella was car ried out by the broth dilution checkerboard method in o rder to study the combined antibacterial effect in clinical application in vitro . T he results suggested that the MI

8、C of single drug o n the standard strains of Escherichia coli and Salmonella was 1to 8g /mL , on the clinical strains was 64to 128g /mL . T he FIC of drug combination w as 0. 5, 0. 75, 1. 5, 0. 5, 0. 75, 1. 0; there were four strains appeared additive effect while the other two strains appeared syne

9、rgistic and irrelevant effect .Key words :Flo rfenicol ; O xy tetr acy cline H ydro chloride ; drug combinatio n每组 10只 , 第 4组为对照组 , 第 1、 2、 3组分别经尾静 脉注射 0. 1、 0. 15、 0. 2m L , 对照组注射生理盐水 0. 2mL , 连续 7d 观察小白鼠反应 , 48h 内不得有死亡 。 1. 2. 4 无菌检验 取本品分别接种到普通琼脂培 养基 、 厌氧培养基及马铃薯葡萄糖琼脂培养基上 , 37 培养 1周 , 观察有无需氧菌 、 厌氧菌

10、 、 霉菌生长 。 1. 2. 5 小白鼠巨噬细胞吞噬功能试验 取成年雄 性小白鼠 40只 , 随机分成 4组 , 第 1组为低剂量转 移因子 组 (每 只 小 白 鼠 腹 腔 注 射 自 制 转 移 因 子 0. 5mL , 第 2组为中等剂量转移因子组 (1mL /只 , 第 3组为高剂量转移因子组 (2mL /只 , 第 4组为对 照组 , 注射等量生理盐水 ; 间隔 24h 后 , 取可溶性淀 粉少许加入蒸馏水中 , 煮沸冷却后 , 每只小白鼠腹腔 注射 1mL ; 再间隔 2h 后 , 取 1%鸡红细胞悬液每只 小白鼠注射 1m L 。 2h 后 , 从腹腔抽取渗出液 , 滴于 载玻

11、片上 , 用盖玻片推成薄片 , 晾干后用美兰染色液 染色 , 油镜下观察 。 计数 100个巨噬细胞中吞噬鸡红 细胞的巨噬细胞为吞噬百分数 ; 100个巨噬 细胞中 平均每个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞数为吞噬指数 。 1. 2. 6 体外抑菌试验 按刘湘新等 (2005 介绍的方法进行操作 , 按一般制备培养基方法无菌培养金 黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌 、 沙门氏菌 、 链球菌 。 将无菌圆形滤纸片浸泡于制备的转移因子中 2h , 制备 成转移因子滤纸片 , 然后分别对金黄色葡萄球菌 、 大 肠杆菌 、 沙门氏菌 、 链球菌进行抑菌试验操作 , 置于 37 温箱中 24h , 观察抑菌圈的大小 。

12、1. 2. 7 TF 的临床治疗试验 选取河南两个发病 猪场 , 经诊断为流行性腹泻和传染性胃肠炎的病猪 各 100头和 60头 , 两群猪分别随机分为 3个试验组 和 1个对照组 , 分别为 、 、 组 , 依次分别使用 TF (0. 2、 0. 1、 0. 05m L /kg 的剂量进行治 疗 , 两群 猪对照组使用氟本尼考 +阿托品 , 观察转移因子的 治疗效果 。 2 结果2. 1 物理性状和理化性质 转移因子制备出来后 呈淡黄色 透 明 液体 。 紫外 光 光 度 计 测定 A 260nm /A 280nm =2. 18, 符合要求 。 加入适量茚三酮溶液 , 加 热后呈紫色 。2.

13、 2 安全试验 由表 1可知 , 注射不同剂量的转移 因子无任何副作用 , 安全 , 可以在临床中使用 。表 1 猪脾转移因子安全试验组别1234数量 (只 20202020注射剂量 TF 0. 1m L /只 TF 0. 15m L /只 TF 0. 2m L /只 生理盐水 0. 2m L /只安全反应无任何副反应无任何副反应无任何副反应无任何副反应2. 3 小白鼠巨噬细胞吞噬功能试验 结果表明 , 注 射转移因子后小白鼠腹腔巨噬细胞的百分率和吞噬 指数与对照组相比 , 均有明显提高 , 差异显著 (P <0. 05 , 结果见图 1和图 2。 由图 1、 图 2可知 , 低剂 量组

14、 、 中等剂量组 、 高剂量组注射 TF 小鼠腹腔巨噬 细胞吞 噬鸡 红 细胞 的 百分 率极 显 著 高于 对 照 组 (P <0. 01 , 表明 TF 能够显著 提高小白鼠腹 腔巨 噬细胞吞噬功能 , 3组剂量相比 , 中等剂量显示较高 的吞噬功能 。图 1 TF 对小白鼠巨噬细胞 吞噬百分率的影响图 2 TF 对小白鼠巨 噬细胞吞噬指数的影响2. 4 体外抑菌试验 试验结果见表 2。 结果表明 金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌 、 沙门氏菌对转移因子比 较敏感 , 而链球菌不敏感 (判定标准为抑菌圈直径大于 11m m 判为敏感 , 小于 11m m 判为不敏感 。表 2 转移因子体

15、外抑菌试验结果菌株抑菌圈直径 (mm 金黄色葡萄球菌 26±1. 3大肠杆菌 42±2. 1沙门氏菌39±1. 7链球菌10±1. 82. 5 TF 的 临床治疗效果 猪脾转移因子 的临床 治疗效果见表 3。 由表 3可知 , 使用 TF 进行治疗 , 其临床治疗效果明显高于对照组 , 而在 、 组治疗 过程中 , 区别不大 。表 3 TF 的临床治疗效果剂量流行性腹泻 传染性胃肠炎头数 治愈数 治愈率 (% 头数 治愈数 治愈率 (% 组 252288151280 组 252288151173 组 25208015853对照组 25176815640

16、3 讨论在制备猪脾转移因子时 , 所用脏器应新鲜 , 匀浆 时应彻底捣碎 , 反复冻融 , 以便使转移因子有效成分 充分释放 。 此种透析方法简便 、 低廉 、 易于操作 , 不 需要特殊的设备和器材 。 转移因子常温下易丧失活 性 , 因此 , 有关操作 (如透析 应在低温下进行 。 常温 下的各种操作均应快捷迅速 。 各步所用蒸馏水均应 无热原 , 保证提取后的转移因子的安全性 。机体免疫系统分为非特异性免疫系统和特异性 免疫系统 , 当特异性免疫系统不能发挥作用的时候 , 机体主要依靠自身的非特异性免疫力抵抗病原微生 物的感染 。 巨噬细胞是体内吞噬病原微生物的重要 细胞之一 , 在炎症

17、 、 感染和抗肿瘤等许多方面起到重 要作用 (金伯泉 , 2003 。 因此巨噬细胞吞噬功能的 增强可以作为衡量机体非特异性免疫力的高低 。 当 有异体物质进入到体内后 , 动物机体会发动体内所 有的巨噬细胞向其靠拢 , 给小白鼠注射鸡的红细胞 可以观察吞噬细胞 的吞噬能力 。 体内试验结 果显 示 , 小白鼠注射转移因子后能明显提高巨噬细胞的 吞噬能力 , 其中 , 中等剂量组的吞噬功能最强 , 而低 剂量组和高剂量组的吞噬功能低于中等剂量组 , 原 因可能在于低剂量组不能充分发挥 TF 的作用 , 而 高剂量组在于过多的注射剂量会导致动物机体应激 反应的发生 , 从而降低了 TF 的作用

18、, 具体原因仍需 进一步研究 。 TF 增强动 物的吞噬功能 , 这对于控 制临床中的一些常见疾病 、 免疫抑制性疾病 (如流行 性腹泻 、 传染性胃肠炎 、 猪瘟 、 猪繁殖与呼吸综合征 、 圆环病毒病 具有重要意义 。体外抑菌试验结果表明 , 转移因子对金黄色葡 萄球菌 、 大肠杆菌 、 沙门氏菌具有明显的抑菌作用 , 说明转移因子对细菌病的预防和治疗也能起到一定 的作用 , 但对链球菌的抑制作用并不非常敏感 , 有待 于进一步研究 。TF 的临床治疗效果显示 , 添加转 移因子的治 疗组明显高于对照组 , 在治疗组中 , 使用中等剂量和 高剂量效果基本上无多大区别 , 而比小剂量效果较

19、好 , 由此可知 , 添加中等剂量的转移因子可提高治疗 效果 。 目前临床上一些疾病产生免疫抑制 , 不但引 起本病的发生 , 同时导致其他已接种疫苗的免疫应 答水平降低 , 导致疾病的混合感染 , 对于这些疾病 , 使用 TF 进行治疗能起到比较好 的效果 , 对 于 TF 如何提高其免疫能力 , 使用转移因子能否提高疫苗 的抗体水平等仍需进一步研究 。参 考 文 献1 孔庆波 , 陈进军 , 常建军 , 等 . 猪转 移因子对 犬中性粒 细胞数量 和 活性的影响 J . 中国畜牧兽医 , 2008, 35(1 :4751.2 冯来坤 , 黄超英 , 杨洪群 , 等 . 转移 因子口服 给药

20、国内 外研究进 展 J . 中国生化药物杂志 , 1999, 20(5 :262263.3 刘湘新 , 刘进 辉 , 何 湘蓉 , 等 . 转移 因子 的制 备与 生物 活 性研 究 J . 中兽医医药杂志 , 2005(6 :3335.4 张萍 , 马春全 , 李冬红 , 等 . 猪脾转 移因子的 制备及其 活性的检 测 J . 黑龙江八一农垦大学学报 , 2007, 19(3 :6871.5 金伯泉 . 细 胞和 分 子免 疫学 M . 第 2版 . 北京 :科 学出 版 社 , 2003, 134137.6 蔡琳昌 . 猪脾转移因子的制 备及质量 控制 C . 第四届 全国转 移 因子学术讨论会论文集 . 北京 :中国科学技术出版社 , 1990:158 161.Preparation and Therapeutically Application forTransfer Factor of Porcine S pleenQ IAO H ong -xing , BAI Jing(Z heng zhou College o f A nimal H usbandry and V eterina ry Engineering , Z hen