一氧化氮和细胞因子之间的相互调节作用

1、    一氧化氮和细胞因子之间的相互调节作用        摘要一氧化氮(NO)作为一种信使参与炎症反应、信号转导、免疫调节及血管舒张等多种功能调节，在许多因素刺激下巨噬细胞产生NO已早为人知，而本文主要简述了淋巴细胞NO的产生，以及NO对淋巴细胞增殖的抑制作用及相关的信号转导通路；淋巴细胞产生的许多细胞因子可以影响自身及巨噬细胞NO的产生，而NO又反过来影响细胞因子的产生，不同免疫细胞所分泌的细胞因子交互调节影响Th1 细胞/Th2 细胞间的平衡状态，从而介导了自身免疫疾病

2、的发生和发展。关键词一氧化氮；细胞因子；淋巴细胞；增殖学科分类号R392.11一氧化氮（nitric oxide,NO)是一种自由基性质的物质，虽然早期发现人体内有亚硝酸盐和硝酸盐(NO-2/NO-3)生成，但直接导致体内NO生物信使作用的发现却是关于内皮依赖性血管舒张作用的研究。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应生成，NOS是NO合成过程中的关键酶，目前已知有三种异构体，神经型(nNOS)和内皮型(eNOS)又称为原生型，为Ca2+依赖型，在细胞内Ca2+浓度升高时被激活，产生生理浓度的NO介导一系列生理功能。诱导型NOS(iNOS)为Ca2+非依赖型，其激

3、活不需要细胞内Ca2+浓度的升高，巨噬细胞、T淋巴细胞、肝细胞、肌细胞及内皮细胞在受到多种刺激因素如外来抗原、脂多糖(LPS)或细胞因子等刺激时，通过启动基因转录合成iNOS，一经表达即具催化活性，且其催化活性及活性持续时间均远超过另两种NOS异构体，因而体内高出生理浓度的NO一般是iNOS被激活的结果。NO有许多生理功能如：血管舒张、抗血小板聚集、作为神经元活动的重要介质，并参与杀灭微生物、杀伤瘤细胞作用，介导一系列免疫病理过程，近来关于NO在免疫细胞相互调节中的作用愈来愈引起人们的重视。一、产生NO的免疫细胞近年在活化巨噬细胞中发现NO是一个主要的细胞毒分子，进而引起了关于NO在炎症中及免

4、疫疾病中作用的广泛研究，除巨噬细胞外其它许多细胞如：T细胞、B细胞、单核细胞、肥大细胞、中性粒细胞及神经胶质细胞等在受到刺激时均可产生NO。同一种细胞在不同情况下可表现不同类型的NOS,且可以相互调节，由星形细胞中nNOS产生的内源性NO可抑制NF-kB的激活，从而使其受致炎因子刺激时iNOS的表达降低,nNOS通过内源性NO抑制iNOS的活性1。NO可通过与细胞内外的靶部位结合产生不同的生物学效应(附表)。附表一氧化氮的靶部位及效应靶部位效应细胞质可溶性鸟苷酸环化酶升高cGMP、扩张血管、抑制血小板聚集、神经传导血红蛋白俘获NO、转运NO至微循环铁硫蛋白抑制酶活性乌头酸酶细胞毒性NADH:泛

5、醌氧化还原酶核糖核苷酸还原酶抑制DNA合成环氧化酶增加活性NOS抑制超氧阴离子去除过氧化物、合成过氧硝酸根离子细胞核NF-kB和Ap-1激活DNA诱发突变、凋亡细胞外白蛋白NO活性的转运及延长纤维蛋白溶酶原激活二、细胞因子对巨噬细胞产生NO的影响巨噬细胞等在未受到致炎因子刺激时不表达iNOS，也无诱生型NO的合成，但iNOS在许多致炎因子的作用下可诱导表达，IFN-是一个有力的诱导剂，TNF-、IL-1和LPS可以增强其刺激作用，其它一些介质如：糖皮质激素、巨噬细胞去激活因子、转录生长因子-、血小板生长因子、上皮生长因子、IL-4和IL-10等则抑制iNOS的产生。iNOS在人细胞中基因定位于

6、第17号染色体，人肝细胞、软骨细胞、结肠肿瘤细胞和肾小球膜细胞均有表达，在人内皮细胞是否有iNOS表达尚未确定。但在人内皮细胞株中，细胞因子可诱导iNOS活性增加，在人巨噬细胞中iNOS的产生较啮齿动物巨噬细胞难，在人单核细胞经LPS和IFN-共刺激可引起iNOS mRNA的表达和蛋白的生成增加，但由于NO过量产生后，导致辅助因子四氢叶酸的缺乏可使NO及其代谢产物进一步产生受限。免疫反应的产生涉及表达MHC 类局部抗原的特异性抗原呈递细胞将抗原呈递给CD4Th细胞，NO可以抑制局部MHC 抗原的呈递2，近年研究表明CD4Th细胞有Th1 细胞和Th2 细胞两种类型细胞，Th1 细胞在IL-12

7、的诱导下由Th0细胞分化而来，可以合成和分泌IL-2、IFN-等；Th2 细胞在IL-4的诱导下由Th0细胞产生，可以分泌IL-4、IL-10、IL-5和IL-13等3。这些细胞因子的产生决定了CD4+T细胞两种亚群的功能，Th1 细胞介导延迟型过敏反应，通过IFN-的产生可以刺激巨噬细胞NO的合成；Th2 细胞分泌的IL-4决定了IgE的产生并表达粘附分子VCAM-1，增加嗜酸性粒细胞的粘附，并促进自身的分化，IL-4和IL-10可下调巨噬细胞iNOS的表达，使NO的产生减少，并可抑制Th1 细胞分泌IFN，细胞因子调节了巨噬细胞NO的产生及CD4+Th1 细胞/Th2 细胞间的平衡，Th1

8、 细胞/Th2 细胞间的平衡失调介导了自身免疫疾病的发生和发展，决定了炎症和自身免疫反应的结局，NO则参与了这个平衡调节。多种细胞因子预刺激巨噬细胞可以抑制其NO的产生，骨髓来源的巨噬细胞在IFN-刺激前，用TNF-、TGF-、IL-4 预处理可分别使NO的产生减少87、92和85，而IFN-刺激后4小时再给以上的细胞因子则对NO 的产生无影响，说明巨噬细胞一旦在接受细胞因子刺激后，则对其它的后继细胞因子刺激无反应，可自身调节其功能4。IL-10在炎症、免疫反应的许多方面是一个关键的抑炎因子，在LPS激活的巨噬细胞IL-10可以显著地抑制细胞因子IL-1、IL-6、GM-CSF、TNF-及粘附

9、分子IL-8、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1)的合成和分泌以及NO的产生，还可以上调MHC 类抗原CD80及CD86。IL-10可以抑制巨噬细胞的增殖，延长培养时间至48小时其抑制作用可达70%90%，胎盘蓝染色及流式细胞仪检测均未发现巨噬细胞死亡或凋亡，进一步研究发现巨噬细胞的生长抑制是由于细胞周期中G1期受阻，使巨噬细胞堆积在G1期所致，IL-10抑制巨噬细胞增殖和去活化的信号转导机制是通过影响偶联于IL-10受体膜内远端细胞质中的酪氨酸磷酸化，其抑制增殖作用通过依赖Stat3的Stat3-Gyrb 通路，去活化作用则是由Stat3非依赖通路介导5。巨噬细胞功能的抑制致使NO的产生减少。三、

10、淋巴细胞NO 的产生除巨噬细胞外淋巴细胞在受到刺激时也可产生NO ，Th1 细胞受到刺激时产生大量的NO，抑制自身IL-2和IFN-的分泌，自身调节免疫反应及Th1 细胞/Th2 细胞间的平衡。Benbernou等6的研究表明，在Jurkat T细胞，可可豆碱(PTX)、db-cAMP及前列腺素E等通过cAMP介导的途径使IL-4和IL10合成增加、IFN-合成下降，同时使iNOS mRNA的表达明显升高，用硝普钠提供外源NO也使IFN-合成明显下降及IL-4分泌升高，应用iNOS的抑制剂L-NMMA可明显的抑制IL-10及IL-4的释放，增加IFN-的合成。说明在T细胞中通过cAMP-PKA

11、途径介导细胞因子的增加，进而可以反馈抑制自身iNOS mRNA 的表达，通过IL-4 的增高诱导Th2细胞的分化。但是也有报道显示T淋巴细胞不能合成NO； B淋巴细胞也可能是NO的来源之一，在转染EB病毒的人类B淋巴细胞及伯基特淋巴瘤细胞株上，可自发地表达iNOS，而不需要LPS及其它抗原的刺激。激活的T淋巴细胞，如小鼠的Th2 细胞、人类未致敏的和记忆CD4+或CD8+T淋巴细胞及某些B淋巴细胞株可以释放IL-13，后者通过抑制巨噬细胞iNOS mRNA及蛋白的合成，使NO的释放减少7。LPS可以刺激小鼠巨噬细胞释放IL-10和IL-12， 而IL-12又参与Th1 淋巴细胞的分化。淋巴细胞

12、释放的细胞因子和巨噬细胞释放的细胞因子，通过细胞间的交互作用而影响免疫功能。四、NO对T细胞增殖的影响Hoffman等的实验首次表明在小鼠脾脏混合淋巴细胞中有硝酸盐和亚硝酸盐的产生，用NOS竞争性抑制剂L-NMMA可以明显增加淋巴细胞增殖。吗啡可抑制免疫系统的许多功能，如抗体形成、淋巴细胞增殖及产生细胞因子的能力。研究发现吗啡抑制刀豆素刺激的大鼠脾淋巴细胞增殖时，脾细胞培养上清中NO-2浓度明显增加，去除脾细胞中巨噬细胞，吗啡升高培养上清中NO-2及抑制淋巴细胞增殖的作用消失，在培养液中加入L-NMMA抑制iNOS或用血红蛋白去除NO，吗啡对淋巴细胞增殖的抑制作用消失，在加入L-Arg后吗啡抑

13、制增殖作用重现，说明吗啡对淋巴细胞增殖的抑制作用是通过NO介导的。此外，广泛烧伤后的免疫缺陷也有NO对淋巴细胞抑制的参与，在皮肤烧伤20%的大鼠，伴随NO的升高脾淋巴细胞的增殖受到抑制，应用L-NMMA后其抑制作用消失8。在iNOS基因缺陷小鼠感染利什曼原虫时，Th1 细胞型免疫反应增强。提示NO可以抑制T细胞的增殖，从而抑制特异性细胞免疫反应。研究表明NO抑制T细胞增殖可能是通过影响了JaK3/STAT5信号转导通路中酪氨酸蛋白激酶的磷酸化，使T细胞在丝裂素原刺激下的晚期分化过程受影响，这时虽然有IL-2分泌和IL-2受体的表达，但在NO的存在下T细胞对IL-2无反应，停留在G0/G1期9。

14、激活的Th1 细胞产生IFN-使巨噬细胞iNOS表达、NO生成增加，NO反过来抑制细胞毒性T细胞增殖，NO与Th1 细胞间的负反馈调节有助于免疫内稳态的维持，在Th1 细胞促发GvHR、类风湿性关节炎、糖尿病、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)及系统性红斑狼疮等免疫过程中，NO的过度合成参与了发病，而产生的NO反过来又抑制Th1 细胞的增殖及许多细胞因子的分泌，防止产生过度的免疫反应，从而延缓免疫病理过程的发展。NO在生理情况下作为一种信使调节机体多种功能，在病理情况下则诱导巨噬细胞等许多细胞iNOS的表达，产生过量NO，形成大量O-2及氮氧化合物，其中毒性较大的是ONOO-,它们具有直接的细胞毒

15、性作用。此外，NO对细胞凋亡也有影响，既能诱导凋亡，也能抑制凋亡。无论是外源性NO，还是由细胞因子、细菌毒素诱导iNOS生成后再合成释放的NO，均能有效的诱导巨噬细胞和T细胞(主要是CD4+CD8+T细胞)凋亡，其机制可能是NO诱导了p53基因表达及p53蛋白合成。而对B淋巴细胞，NO可通过诱导bcl-2表达，抑制细胞凋亡。五、NO对巨噬细胞产生细胞因子的影响NO可以下调肺脏巨噬细胞炎性细胞因子的产生，在急性肺损伤、缺血-再灌注所致炎症或肺移植排斥反应时，NO的有益作用部分是由于减少了炎性细胞因子IL-1和TNF-的释放。NO抑制细胞因子的产生可能发生在转录前水平，转录因子NF-kB介导了TN

16、F-和IL-1的产生，而NO则抑制了内毒素等所致的NF-kB的活化。在野生型和iNOS基因缺陷鼠，LPS和IFN-所致内源性诱生型NO及NO供体SNAP提供外源性NO均可抑制巨噬细胞IL-1和IFN-诱导因子(IGIF or IL-18)的释放，用caspase-1的阻断剂Ac-YVAD-cho可以模拟NO的抑制作用，说明NO抑制IL-1和IGIF的释放是抑制了caspase-1的激活，其抑制作用可被DTT反转则进一步表明，caspase-1的失活是由于S-亚硝基化作用所致，caspase-1是IL-1前体和IGIF前体裂解所必需的蛋白酶，前体裂解受阻致使IL-1和IFN-合成和释放减少，在体

17、实验也表明iNOS的表达也抑制了体内IL-1和IFN-的释放10。IL-1和IFN-可使许多细胞表达iNOS产生NO，而大量NO的产生可以提供反馈抑制caspase-1的活化而使IL-1和IFN-合成和释放减少，从而自身调节iNOS的活性及NO的产生，下调炎症反应、预防组织损伤。总之，NO与免疫细胞产生的细胞因子交互作用，调节了CD4+Th1 细胞/Th2 细胞间的平衡并影响了NO自身的产生，使机体的免疫调节处于恰当的水平，从而防止了自身免疫性疾病及炎症的发生和发展。刘建国(北京医科大学第三医院血管医学研究所,北京100083)王宪(北京医科大学第三医院血管医学研究所,北京100083)陈明哲

18、(北京医科大学第三医院血管医学研究所,北京100083)参考文献1，Togashi H,Sasaki M,Frohman E,et al.Neuronal (type I) nitric oxide synthase regulates nuclear factor，kB activity and immunologic (type II) nitric oxide synthase expression.Proc Natl Acad Sci USA,1997,9426762680.2，Sicher SC,Vazquez MA,Lu CY,et al.Inhibition of macroph

19、age la expression by nitric oxide.J Immunol,19943，O'Garra A.Cytokines induce the development of functionally heterogeneous T helper cell subsets.Immunity,1998,8275283.4，Erwig LP,Kluth DC,Walsh GM,et al.Initial cytokine exposure determines function of macrophages and renders them unr

20、esponsive to other cytokines.J Immunol,1998,16119831988.5，O'Farrell AM,Liu Y,Moore KW,et al.IL-10 inhibits macrophage activation and proliferation by distinct signaling mechanisms: evidence for Stat3-dependent and -independent pathways.EMBO,1998,1710061018.6，Benbernou N,Esnault S,Shin HCK,et al.Differential regulation of IFN-,IL-10 and inducible nitric oxide synthase in human T cells by cyclic AMP-dependent signal transduction pathway.Immunology,1997,91361368.7，Bogdan C,Thuring H,Dla