第4章 蛋白质的共价结构

1、蛋白质蛋白质 （ProteinProtein）1838年，年，J. J. Berzelius提出，由提出，由proteios衍生而来衍生而来 第一重要，首要的物质第一重要，首要的物质l蛋白质存在于蛋白质存在于所有所有生物细胞中，是生物细胞中，是构成生物体最基本的构成生物体最基本的结构物质和功结构物质和功能物质。能物质。l蛋白质是生命活动的物质基础，参蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。与了几乎所有的生命活动过程。一、蛋白质通论一、蛋白质通论、蛋白质的含氮量、蛋白质的含氮量v蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。v大多数蛋白质含氮量

2、接近于大多数蛋白质含氮量接近于16%16% 蛋白质含量蛋白质含量 = = 每克样品中含氮的克数每克样品中含氮的克数 6.256.25v凯氏定氮法凯氏定氮法、蛋白质的分类、蛋白质的分类（1 1）、依据外形分类）、依据外形分类 球状蛋白质：球状蛋白质：globular protein 纤维状蛋白质纤维状蛋白质：fibrous protein 膜蛋白质膜蛋白质：membrane protein （2 2）、依据蛋白质的组成分类）、依据蛋白质的组成分类 简单蛋白简单蛋白 simple protein 单纯蛋白，仅由氨基酸组成单纯蛋白，仅由氨基酸组成 结合蛋白结合蛋白 conjugated protei

3、n由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成简简单单蛋蛋白白 清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 广泛存在于动物组织广泛存在于动物组织 谷蛋白和醇溶谷蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/ /碱碱 精蛋白和组蛋白精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核碱性蛋白存在于细胞核 硬蛋白硬蛋白 结结合合蛋蛋白白 色蛋白：色蛋白：简单蛋白简单蛋白+ +色素物质色素物质 糖蛋白：糖蛋白：简单蛋白简单蛋白+ +糖类物质糖类物质 脂蛋白：脂蛋白：简单蛋白简单蛋白

4、+ +脂类结合脂类结合 核蛋白核蛋白：简单蛋白：简单蛋白+ +核酸核酸（二）、蛋白质的大小与分子量（二）、蛋白质的大小与分子量 蛋白质是分子量很大的生物分子蛋白质是分子量很大的生物分子 对任一种给定的蛋白质，其所有分子在对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AAAA组成和顺序以及肽链的长度组成和顺序以及肽链的长度方面都应方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。是相同的，即所谓均一的蛋白质。l蛋白质与多肽无严格的界线蛋白质与多肽无严格的界线 通常将通常将6000Dr6000Dr以上的多肽称为蛋白质。以上的多肽称为蛋白质。l蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大蛋白质蛋白质月示月示胨胨多肽多肽

5、肽肽AAAA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500（三）蛋白质构象和结构的组织层次（三）蛋白质构象和结构的组织层次蛋蛋白白质质的的结结构构层层次次一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构四级结构四级结构高级结构高级结构空间构象空间构象示示例例（四）、蛋白质功能的多样性（四）、蛋白质功能的多样性 1. 1. 催化功能催化功能- -酶酶 2. 2. 调节功能调节功能- -激素、基因调控因子激素、基因调控因子 3. 3. 转运功能转运功能- -膜转运蛋白、血红膜转运蛋白、血红/ /血清蛋白血清蛋白 4. 4. 贮存功能贮存功能

6、- -乳、蛋、谷蛋白乳、蛋、谷蛋白 5. 5. 运动功能运动功能- -鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白 6. 6. 结构成分结构成分- -皮、毛、骨、牙、细胞骨架皮、毛、骨、牙、细胞骨架 7. 7. 支架作用支架作用- -接头蛋白接头蛋白 8. 8. 防御功能防御功能- -免疫球蛋白免疫球蛋白 9. 9. 异常功能异常功能AA-NHAA-NH2 2与另一与另一AA-COOHAA-COOH间失水形成的酰胺键间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。称肽键，所形成的化合物称肽。l由两个由两个AAAA组成的肽称为二肽。组成的肽称为二肽。l由多个由多个AAAA组成的肽则称为多肽。组成的肽则称为多肽。l

7、组成多肽的组成多肽的AAAA单元称为氨基酸残基。单元称为氨基酸残基。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键 多肽链中多肽链中AAAA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 含游离含游离 - -氨基的一端：氨基端或氨基的一端：氨基端或N-N-端端 含游离含游离 - -羧基的一端：羧基端或羧基的一端：羧基端或C-C-端端 AAAA顺序是从顺序是从N-N-端开始以端开始以C-C-端氨基酸残基为终点端氨基酸残基为终点 如上述五肽：如上

8、述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Gln（一）、肽和肽键的结构（一）、肽和肽键的结构肽键中肽键中C-NC-N键有部分键有部分 双键性质双键性质 不能自由旋转不能自由旋转组成肽键原子处于组成肽键原子处于 同一平面（肽平面）同一平面（肽平面）键长及键角一定键长及键角一定大多数情况以反式大多数情况以反式 结构存在结构存在共价主链共价主链 肽末端肽末端-羧基羧基pKa值比游离值比游离AA中的大。中的大。 肽末端肽末端-氨基氨基pKa值比游离值比游离AA中的小。中的小。 等电点（两性）。等电点（两性）。 酸碱性质取决于：酸碱性质取决于： -羧基、羧基、-氨基、

9、侧链基团的解离氨基、侧链基团的解离 具有双缩脲反应具有双缩脲反应Pr特有的反应。特有的反应。（三）、（三）、 天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鹅膏覃碱的化学结构CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催产素CysTyrGlnAsnCysProSSPheArgGlyNH2牛加压素三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定什么是什么是PrPr的一级结构？的一级结构？蛋白质中氨基酸的排列

10、顺序。 1.1.样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）以上） 2.2.知道蛋白质的分子量知道蛋白质的分子量 3.3.知道蛋白质由几个亚基组成知道蛋白质由几个亚基组成 4.4.测定蛋白质的测定蛋白质的AAAA组成并根据分子量组成并根据分子量 计算每种计算每种AAAA的个数的个数 5.5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量测定水解液中的氨量计算酰胺的含量前提前提（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽白质分子量之间的关系，即可

11、确定多肽链的数目。链的数目。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(2)(2) 多肽链的拆分多肽链的拆分（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略 几条多肽链借助几条多肽链借助非共价键非共价键连接在一起，连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。烯醇化酶为二聚体。 可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，盐酸胍处理，即可分开多肽链即可分开多肽链( (亚基亚基) )。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(3)(3) 断开二硫键断开二硫键 在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol

12、/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的 - -巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还处理，使二硫键还原为巯基，然后用原为巯基，然后用烷基化试剂保护烷基化试剂保护生成生成的巯基，防止重新被氧化。的巯基，防止重新被氧化。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(4)(4)测定每条多肽链的测定每条多肽链的AAAA组成，并计算组成，并计算出出AAAA成分的分子比成分的分子比 （一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(5)(5)分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端(6)(6)多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段 采用两采用两/ /多种多种不同的断裂方法

13、不同的断裂方法将多肽将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。断裂成两套或多套肽段，并将其分离。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(7)(7)测定每个肽段的氨基酸顺序测定每个肽段的氨基酸顺序(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序 利用两利用两/ /多套肽段的多套肽段的AAAA顺序彼此间的顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AAAA顺序。顺序。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。 两类多肽链末端氨基酸残基：两类多肽链末端氨基酸残基： N-N-端氨基酸端氨基酸

14、 C-C-端氨基酸端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸残基测定（二）、末端氨基酸残基测定 Sanger法法 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法O2NFNO2+ H2N CH CROHN CH CROO2NNO2H+H2OO2NNO2HN CH CROOH+氨基酸氨基酸DNFBN-端氨基酸端氨基酸DNP衍生物衍生物DNP-氨基酸氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定N碱性条件碱性条件二硝基苯衍生物二硝基苯衍生物黄色黄色 二甲氨基萘磺酰二甲氨基萘磺酰-AA-AA

15、有强荧光，检测灵敏度高有强荧光，检测灵敏度高 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定1N(DNS-aa)苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC)PITC)法法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定1NN=C=S + NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯苯异硫

16、氰酸酯PITC 肽链外切酶肽链外切酶: :从多肽链从多肽链N-N-端逐个向里水解端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的根据不同反应时间测出释放的AAAA种类和数量，种类和数量， 按反应时间和按反应时间和AAAA残基释放量作动力学曲线残基释放量作动力学曲线 蛋白质蛋白质N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以水解以LeuLeu残基为残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。氨肽酶法氨肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定1N 肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物

17、质 肼解法肼解法H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定2C（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定2C C末端末端AA AA 氨基醇氨基醇 还原法还原法硼氢化锂硼氢化锂 肽链外切酶肽链外切酶: :从多肽链从多肽链C-C-端逐个水解端逐个水解 根据不同反应时间释放出的根据不同反应时间释放出的AAAA种类和数量种类和数量 蛋白质蛋白质C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。 四种羧肽酶：四种羧肽酶：A

18、,B,CA,B,C和和Y Y； A A和和B(B(胰脏胰脏) )、C(C(柑桔叶柑桔叶) )、Y(Y(面包酵母面包酵母) ) A:A:除除Pro/Arg/Lys/Pro/Arg/Lys/外所有外所有C-C-末端末端AAAA残基残基 B: B:只水解只水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键末端残基的肽键 羧肽酶法羧肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定2C（三）、二硫键的断裂（三）、二硫键的断裂 盐酸胍盐酸胍/ /尿素解离多肽链间的非共价力。尿素解离多肽链间的非共价力。 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫

19、键。链间的二硫键。1 1、酸水解、酸水解（四）、氨基酸组成的分析（四）、氨基酸组成的分析2 2、碱水解、碱水解1 1、酶解法酶解法: : 内切酶：内切酶：胰蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解 （五）、多肽链的部分裂解和（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分离纯化 R1=Lys（K）和）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制）（抑制）NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH

20、 COR1肽链肽链水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶trypsin R1=Phe（F）、）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性）等疏水性AA Leu、Met和和His稍慢稍慢 R2=Pro（抑制）（抑制） pH8-9NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽链肽链水解位点水解位点糜蛋白酶糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻水解速度与相邻AAAA性质有关性质有关: : 酸性：酸性：-/-/碱性：碱性：+ + R2=Phe（F）、）、 Trp（W）、）、 Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I）、）、Met（M

21、）、）、Val（V）及其它）及其它疏水性强的疏水性强的AA水解速度较快水解速度较快NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点R2= Pro或或Gly，不水解，不水解R1或或R3=Pro，抑制水解，抑制水解嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶（thermolysin) R1和和/或或R2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、 Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解速度较快水解速度较快 R1=Pro（抑制）（抑制） pH2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶PepsinNH

22、CHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点羧肽酶和氨肽酶羧肽酶和氨肽酶2 2、化学裂解法、化学裂解法 溴化氰水解法溴化氰水解法(Cyanogen bromide)选择性地切割由选择性地切割由MetMet羧基形成的肽键。羧基形成的肽键。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯（五）、多肽链的部分裂解和（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分

23、离纯化多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解 NH2OH断裂：断裂： 较专一性断裂较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键之间的肽键 Asn-Leu及及Asn-Ala键也能部分断裂键也能部分断裂 3 3、肽段的分离纯化：、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和凝胶过滤、凝胶电泳和HPLCHPLC法法N-N-端分析法端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链特点：能够不断重复循环，将肽链N-N-端端氨基酸残基逐一进行标记和解离。氨基酸残基逐一进行标记和解离。1 1、 （六）、肽段氨基酸序列的测定（六）、肽段氨基酸序列的测定Edman于于1950年首先提出。年首先提出。PITCPTC-肽肽2 2、氨肽酶法或

24、羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽酶法3 3、质谱法（、质谱法（MSMS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快灵敏度高、所需样品少、测定速度快核糖体核糖体蛋白质链蛋白质链4.4.根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法（七）、肽段在多肽链中次序的决定重叠肽（重叠肽（overlaping peptide） 胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 经电泳分离各肽段经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键，含有用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性的肽段带电性质发生变化，转向质发生变化，转向90二次电泳，曾含二硫键二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置硫键的位置（八）、二硫键位置的确定