复方五仁醇胶囊含药血清中木脂素类成分的UPLC_MS_MS分析_窦志华

1、2007年4月第29卷 第4期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineApril2007Vo.l29 No.4循信息量最大化的原则,选择280nm波长作为本指纹图谱的测定波长。3.4.3 梯度时间的设定060min采用不同梯度进行洗脱,使全部峰均匀分布且有效分离。2h色谱图表明该洗脱方法洗脱完全,足以保证下一次分析的正常进行。3.4.4 柱温的选择为了保持色谱分析的一致性,分别对25 、30 、35 柱温进行考察,决定柱温设在30 。3.4.5 流速的设定在其它色谱条件一致的情况下,分别对0.8、1.0、1.2mL/min的流速条件进行考察,从对色谱图的整体分离效

2、果的考虑出发,选择1.0mL/min的流速较为适宜。3.4.6 进样量的考察取供试品溶液分别进样5,10,15,20,25 L,记录色谱图,故选择10 L为本方法的进样量,既可以最大程度的减少对色谱柱的污染,又可以在浓度变化的有效范围内保证稳定性。3.4.7 色谱柱的考察TM我们在实验的初级阶段使用了WatersXTerraRP185 m3.9mm 150mm、SymmetryC185 m3.9mm 150mm发现前两款柱子的分离效果不好,TMWatersSunFireC184.6mm 250mm5 m液相色谱柱分离效果很好,并且基线平稳,故我们选择了WatersSunFireC184.6mm

3、 250mm5 m液相色谱柱。3.4.8 不同仪器的考察在相同的色谱条件下,分别在岛津LC-2010及Waters2695型液相色谱仪上对同一批样品进行检测,结果得到的色谱图基本相同。通过以上条件的选择确定了注射用广炎灵粉针指纹图谱研究的色谱条件。参考文献:1 谢培山.中药制剂色谱指纹图谱(图像)鉴别J.中成药,2000,22(6):391-395.2 白求恩医科大学医院传染科.丁香片剂制备及其对黄疸性肝炎的临床效果J.中草药通讯,1978(1):18.TM复方五仁醇胶囊含药血清中木脂素类成分的UPLC-MS/MS分析窦志华, 丁安伟, 居文政, 罗 琳(1.南京中医药大学药学院,江苏南京21

4、0029;2.南京中医药大学附属医院临床药理科,江苏南京210029;3.南通大学医学院,江苏南通226006)关键词:复方五仁醇胶囊;含药血清;木脂素类成分;超高效液相色谱-串联质谱摘要:目的:分析复方五仁醇胶囊大鼠灌胃后消化吸收进入血液的木脂素类成分,以便与该制剂血清药理学研究相结合,阐明其药效物质基础。方法:采用UPLC-MS/MS方法,比较复方五仁醇胶囊含药血清、体外制剂、空白血清及对照品提取离子流色谱图(EIC),并通过质谱图相关离子峰分析,确认进入血液的木脂素类成分。结果:发现制剂中存在的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素5个木脂素类成分进入血液。结论:这5

5、个木脂素类成分很可能是复方五仁醇胶囊体内直接作用物质的重要组成部分,结合血清药理学作进一步研究有助于阐明该制剂药效物质基础。中图分类号:R944.2+7 文献标识码:A 文章编号:1001-1528(2007)04-0550-051*23AnalysisoflignansintheserumofratsafteroraladministrationofCompoundWurenchunCapsulesbyUPLC-MS/MSDOUZh-ihua, DINGAn-wei, JUWen-zheng, LUOLin1*23收稿日期:2006-07-08基金项目:江苏省中医药局中医药科学技术研究专项课

6、题(编号H05173);江苏省高校研究生科技创新计划项目(编号140);江苏省南通市社会发展科技计划项目(编号S40006)作者简介:窦志华(1966),男,副主任中药师,博士研究生,主要从事中药复方药效物质基础研究工作。*通讯作者:丁安伟,教授,博士生导师,电话E-mai:ldaw。5502007年4月第29卷 第4期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineApril2007Vo.l29 No.4(1.PharmacySchool,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing

7、210029,China;2.DepartmentofClinicalPharmacology,HospitalAf-filiatedtoNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;3.MedicineSchool,NantongUniversity,Nantong226006,Chi-na)KEYWORDS:CompoundWurenchunCapsules;serumcontainingdrug;lignans;UltraperformanceLiquidChro-matography-TandemMa

8、ss(UPLC-Mass/Mass)ABSTRACT:AIM:ToilluminatethetherapeuticbasisofCompoundWurenchunCapsulesincombinationwithserumpharmacology,thelignansofthispreparationmigratingtobloodofratsafteroraladministrationhavingbeenaccomplished.METHODS:ByUPLC-MS/MSmethod,lignansmigratingtobloodwereaffirmedbycomparingtheextra

9、ctedionchromatography(EIC)oftheserumcontainingdrugwiththeonesofCompoundWurenchunCap-sules,thecontrolserumandcontrolarticles,correlatedionpeakinmass-spectrogramwereanalyzedatthesametime.RESULTS:Fivelignansmigratingtobloodhavebeenfound,theyareschisandrin,schisandrolB,schisan-therin,deoxyschizandrinand

10、schisandrinB.CONCLUSION:FivelignansabovementionedarelikelytheeffectivesubstancesofCompoundWurenchunCapsulesinhumanbody.Morestudybymeansofcombiningwithserumphar-macologywillilluminatethetherapeuticbasisofthispreparation. 面对中药这一复杂体系,20世纪80年代日本学者提出了 血清药理学(SerumPharmacology) 与 血清药化学(SerumPharmacochemist

11、ry) 研究方法11.1 仪器Waters液相色谱-质谱联用仪(UltraperformanceLC,QuattraPremier质谱仪,Masslynx4.0软件,美国Waters公司),ZORBAXC18固相小柱(美国Agilent公司),1001000 L芬兰可调式移液器(上海雷勃分析仪器有限公司),LIBRORAEL-40SM电子分析天平(日本SHIMADZU公司)。1.2 药品与试剂五味子醇甲(批号1171-040208)、五味子乙素(批号1173-040110)购自江西南昌中药固体制剂制造技术国家工程研究中心,五味子酯甲(批号1529-200001)、五味子甲素(批号0764-20

12、00107)购自中国药品生物制品检定所,五味子醇乙购自天津一方科技有限公司。复方五仁醇胶囊(批号050505)由南通市第三人民医院提供。乙腈(色谱纯,德国MERK公司),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司),其余试剂均为分析纯。1.3 动物SD大鼠,SPF级,体重(248.4 16.3)g, 各半。南通大学实验动物中心提供,许可证号SYKX(苏)2002-0022。2 实验方法2.1 分析条件超高效液相色谱条件:AcquityUPLCBEHC18色谱柱(2.1mm 50mm,1.7 m);A(乙腈)-B(H2O,0.1%甲酸)梯度洗脱(015min,A:5%95%;B:95%5%);流速0.5mL

13、/min;分流后进入质谱;柱温40 。质谱条件:ES;毛细管电压:3.0kV:锥孔电压:40V;离子源温度:120 ;氮气流量:400L/h;+,这种方法的基本思路是:中药虽成分众多,但只有那些被消化吸收进入血液的成分或其代谢产物才有产生药效的可能,中药药效物质基础研究应以给动物或人服用药物后的血清(即含药血清,serumcontainingdrug)为入手点。血清药理学主要通过体外试验研究含药血清药效及作用机理,血清药化学主要是对进入血清的成分及其代谢产物进行分析、分离、鉴定等。这样不仅可以大大简化中药复方这一复杂体系,而且对血清中所含复方化学成分进行进一步分析、鉴定,把得到的成分与复方再次

14、进行药效学比较,就有可能揭示产生复方药效的成分制剂4,52,3。复方五仁醇胶囊是一种治疗急慢性肝炎的科研,组方简单,疗效确切,我们以此为对象进行血清药理学与血清药化学相结合探寻中药复方药效物质基础的方法学探讨。该制剂由五味子、三七、柴胡等4味药组成,其中五味子为君药。以往的研究已经建立了体外制剂、含药血清的HPLC指纹图谱,并对指纹图谱中部分共有峰进行了鉴定及含量测定610,结果表明,制剂指纹图谱26个共有峰有24个来自五味子,含药血清13个共有峰全部为制剂中五味子的原型成分或代谢产物,鉴定出的4个入血成分均为五味子所含木脂素。文献研究也表明,木脂素类成分是五味子保肝作用的主要活性成分11。因

15、此,本次研究采用了灵敏度更高的UPLC-MS/MS方法,重点对含药血清中的木脂素类成分进行了分析。1 实验材料2007年4月第29卷 第4期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineApril2007Vo.l29 No.4质量扫描范围:m/z3001200。2.2 血清的制备按文献方法8分别精密称取各对照品适量,甲醇溶解并逐步稀释,配制成分别含五味子醇甲4.46 g/mL、五味子醇乙4.36 g/mL、五昧子酯甲4.16 g/mL、五味子甲素4.32 g/mL、五味子乙素4.13 g/mL的混合对照品溶液,进样前0.45 m微孔滤膜过滤。2.6 样品测定以上分析条件

16、下分别吸取各对照品溶液、制剂供试品溶液、含药血清、空白血清供试品溶液各2 L,注入液相色谱-质谱联用仪进行分析,运行15min,记录总离子流色谱图(TIC),通过各成分提取离子流色谱图(EIC)及相应保留时间离子峰的质谱图比对分析确认成分。3 结果与讨论3.1 总离子流图显示,5种木脂素类成分的tR<4.5min,空白血清对检测基本没有干扰。根据各对照品单独进样检测,对照品总离子流图中tR为1.79、2.11、3.01、3.76、4.12min的成分分别为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。见图1。制备大鼠含药血清和空白血清。2.3 血清供试品溶液的制备取含药血清

17、、空白血清各1mL,分别加在活化后的C18固相小柱上(小柱活化:分别用甲醇1mL、水1mL过柱),待样品全部流出小柱后,用水1mL洗涤并将小柱置离心管内3000r/min离心10min将水充分甩出,用甲醇1mL过柱,3000r/min离心10min,收集甲醇,80 水浴锅上蒸干,用微量移液器精密加入甲醇100 L,并超声使残渣充分溶解,16000r/min离心10min,上清液即为含药血清、空白血清供试品溶液。2.4 制剂供试品溶液的制备精密称取复方五仁醇胶囊内容物0.5g,置25mL量瓶中,加甲醇适量,浸泡5h,超声处理30min,甲醇定容至刻度,摇匀,过滤,取续滤液进样前0.45 m微孔滤

18、膜过滤。2.5 对照品溶液的制备图1 对照品(A)、体外制剂(B)、含药血清(C)及空白血清(D)总离子流色谱图Fig.1 TICofreferencesubstance(A),preparation(B),serumcontainingdrug(C)andblankserum(D)3.2 通过对对照品、体外制剂、含药血清及空白血清各成分提取离子流色谱图(EIC)及相应保留时间离子峰质谱图的比对分析,在制剂和含药血清中均发现了五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素5个木脂素类成分。见图2图10。3.3 超高效液相色谱法(UPLC)是美国Waters公司近年推出的一种新的液相

19、色谱技术,采用1.7 m的小粒径色谱柱填料,不仅使柱效得以提高,而且在较宽的流速范围内柱效保持恒定,同当前最快的工业标准高效液相色谱系统(HPLC)相比,UPLC的速度快了9倍,分辨率高出2倍,灵敏度高出3度12。此前进行的含药血清HPLC指纹图谱研究标出107批含药血清色谱图共有峰13个,其中8个为制剂原形成分入血,5个为代谢产物,鉴定出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素4个成分木脂素类。但是,限于HPLC灵敏度,估计血清中还有一些含量较低的成分没有检测出来。本次实验采用灵敏度更高的UPLC-MS/MS方法,检测到另一个含量更低的五味子木脂素类成分五味子酯甲,证实了以上推断。图2

20、 对照品(A)、体外制剂(B)、含药血清(C)及空白血清(D)五味子醇甲(m/z:433)提取离子流色谱图Fig.2 EICofschisandrin(m/z:433)inreferencesubstance(A),preparation(B),serumcontainingdrug(C)andblankserum(D)5522007年4月第29卷 第4期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineApril2007Vo.l29 No.4图3 对照品(A)、体外制剂(B)及含药血清(C)五味子醇甲质谱图Fig.3 Mass-spectrogramofschisandr

21、ininreferencesubstance(A),preparation(B)andserumcontainingdrug(C)图4 对照品(A)、体外制剂(B)、含药血清(C)及空白血清(D)五味子酯甲(m/z:559)提取离子流色谱图Fig.4 EICofschisantherin(m/z:559)inreferencesubstance(A),preparation(B),serumcontainingdrug(C)andblankserum(D)图5 对照品(A)、体外制剂(B)及含药血清(C)五味子酯甲质谱图Fig.5 Mass-spectrogramofschisantherin

22、inreferencesubstance(A),preparation(B)andserumcontainingdrug(C)图6 对照品(A)、体外制剂(B)、含药血清(C)及空白血清(D)五味子醇乙(m/z:417;tR:2.11-2.12)和五味子甲素(m/z:417;t.76-3.78)提取离子流色谱图R:3Fig.6 EICofschisandrolB(m/z:417;t:2.11-2.12)anddeoxyschisandrin(m/z:417;t:3.76-3.78)inreferencesub-RRstance(A),preparation(B),serumcontaining

23、drug(C)andblankserum(D)2007年4月第29卷 第4期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineApril2007Vo.l29 No.4图7 对照品(A)、体外制剂(B)及含药血清(C)五味子醇乙质谱图Fig.7 Mass-spectrogramofschisandrolBinreferencesubstance(A),preparation(B)andserumcontainingdrug(C)图8 对照品(A)、体外制剂(B)及含药血清(C)五味子甲素质谱图Fig.8 Mass-spectrogramofdeoxyschisandrinin

24、referencesubstance(A),preparation(B)andserumcontainingdrug(C)图9 对照品(A)、体外制剂(B)、含药血清(C)及空白血清(D)五味子乙素(m/z:401)提取离子流色谱图Fig.9 EICofschisandrinB(m/z:401)inreferencesubstance(A),preparation(B),serumcontainingdrug(C)andblankserum(D)5542007年4月第29卷 第4期中成药ChineseTraditionalPatentMedicineApril2007Vo.l29 No.4图1

25、0 对照品(A)、体外制剂(B)及含药血清(C)五味子乙素质谱图Fig.10 Mass-spectrogramofschisandrinBinreferencesubstance(A),preparation(B)andserumcontainingdrug(C)参考文献:1 贺玉琢.日本汉方药 血清药理学 、 血清药化学 的研究概况J.国外医学中医中药分册,1998,20(5):3-7.2 周 俊.中药复方 天然组合化学库与多靶作用机理J.中国中西医结合杂志,1998,18(2):67.3 赵建荣,李晓玫.中药复方物质基础研究的现状与进展J.中草药,2003,34(11):963-966.4 窦志华,施 忠,李伟红,等.复方五仁醇胶囊的研制J.时珍国医国药,2005,16(10):953-957.5 达坤林,王陆军,张 兵,等.复方五仁醇胶囊治疗慢性乙型肝炎78例临床疗效观察J.时珍国医国药,2006,17(5):798.6 窦志华,丁安伟,王陆军,等.复方五仁醇胶囊HPLC指纹图谱研究J.山东中医药大学学报,2006,30(5):384-387.7 窦志华,丁安伟,王陆军,等.复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱研究A.肖诗鹰,何 勤.中药产业现代化推进战略论从M.杭