复方水蛭胶囊防治动脉粥样硬化单因素效应分析

1、复方水蛭胶囊防治动脉粥样硬化单因素效应分析                     作者：张潮林， 胡旭光， 宋增炫， 沈雪梅【关键词】  黄芪肠宁颗粒；,提取工艺；,溃疡性结肠炎；,药效学摘要：目的探讨复方黄芪肠宁颗粒的提取工艺。方法观察不同提取工艺制得的提取物，对溃疡性结肠炎模型小鼠经保留灌肠后体征变化及病理组织学变化。结果4种不同提取工艺的提取物都可改善模型小鼠的体征和病理组织学变

2、化；工艺3效果最显著。结论 工艺3为较优的提取工艺，即部分药材先用70%乙醇提取，药渣再与其余药材共水煎煮的提取工艺。关键词：黄芪肠宁颗粒；  提取工艺；  溃疡性结肠炎；  药效学Abstract：ObjectiveTo investigate the extract technology of compound HuangQi ChangNing granula.MethodsTo observe the physical signs and the pathological tissue change of ulcerative colitis mice g

3、iven compound HuangQi ChangNing granula by different extraction technologies. ResultsAll the different extract compounds could improve the physical signs and the pathological tissue changes; the effect of technology NO.3 was better than that in other groups.ConclusionTechnology NO.3 was selected as

4、the optimal extract technology.    Key words：HuangQi ChangNing granula;   Extract technology;   Ulcerative colitis;  Pharmacodynamics     复方黄芪肠宁汤的处方，是在中医药理论指导下，针对溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)的病因病机，由黄芪、补骨脂、仙鹤草等药组成。该方具有益肾健脾、化湿清热、通经生肌的功效。临床上将其制成煎煮液

5、，通过保留灌肠治疗溃疡性结肠炎，取得了良好疗效。但因需临时制备，临床使用不方便，且药液质量难于控制。因此，作者拟将其研制成临床上使用方便、质量稳定可控的颗粒剂。不同提取工艺制得的提取液中所含成分是不同的，因而会导致药效的差异。本文采用小鼠实验溃疡性结肠炎模型，对复方黄芪肠宁方剂的4种不同提取工艺制得的提取物做药理效应的比较，以确立复方黄芪肠宁颗粒的初步提取工艺，为进一步优化该制剂的提取工艺奠定基础。1  材料1.1  动物昆明种小鼠（体重1822 g ，雌雄各半，广东省实验动物中心，SCX粤20030002）。1.2  药品 柳氮磺吡啶（SASP，上海三维制药有限

6、公司，批号200510C21）；醋酸（化学醇）；药材（广州市致信药业，经鉴定符合中国药典2005年版标准）。2  方法2.1  模型的建立1，2小鼠禁食不禁水12 h，经肛门向结肠内注入5的醋酸溶液0.1 ml（小鼠肛门内约3 cm），然后正常饲养1 d，即得。2.2  供试药液的制备工艺1提取液：按处方比例称取药材，分别加入10，8倍量水，回流提取两次，分别为1.5，1.0 h/次，合并药液，过滤，滤液经离心（30005000 r/min，10 min），取上清液，浓缩到每毫升相当于药材4.8 g，即14.8，即得。 工艺2提取液：按处方比例称取药材，分别加入1

7、0倍量、8倍量水，回流提取2次，分别1.5，1.0 h/次。合并药液，过滤，滤液浓缩至300 ml，加入乙醇调整含醇量达50，静置24 h，减压滤过，滤液回收乙醇，继续浓缩到14.8，即得。工艺3提取液：按处方比例称取黄芪、补骨脂等4味药材，加入8倍量70乙醇回流提取1.5 h，过滤，滤液回收乙醇至无乙醇味，备用，得；药渣与其余药材加水共煎，分别加入10，8倍量水，煎煮1.5，1.0 h，过滤。合并滤液 ，浓缩至150 ml，加入乙醇调整含醇量至50，静置24 h，减压过滤，回收乙醇，浓缩，与醇提液混合，继续浓缩到14.8，即得。工艺4提取液：按处方比例称取黄芪等4味药材，分别加入8，6倍量7

8、0乙醇，回流提取2次，1.5，1.0 h/次。药液经过滤，回收乙醇，浓缩至无乙醇味，得药液；取仙鹤草等其余药材，分别加入10，8倍量水，回流提取两次，合并滤液，过滤，与混合，继续浓缩至14.8，即得。 阳性对照药液： 精密称取SASP1.375 g，用0.5的羧甲基纤维素钠水溶液研磨，定容至25 ml，混匀，即得。本品为每毫升含SASP0.055 g的混悬液。2.3  分组与给药方法将造模小鼠随机分为7组，包括工艺1，2，3，4组、阳性对照组、空白对照组、模型组。各组动物灌药前禁食不禁水12h，按照人与动物等效剂量换算方法确定小鼠的给药量。4个工艺组分别给予不同提取工艺制备的提取液，

9、每次给药0.1ml（相当于生药26.2g/）；阳性对照组给予SASP的混悬液0.1ml（相当于0.27g/kg）；空白对照组给予蒸馏水0.1ml；模型组造模后正常喂养。同时设立正常组。每组小鼠灌药1次/d，连续3 d。给药期间观察各项体征指标，3 d后处死，观察结肠病理指标。2.4  观察指标22.4.1  体征指标 观察小鼠的体重、活动、毛色、大便、进食等状况，重点观察是否腹泻及脓血便等。正常大便指形成颗粒样便；半稀便指糊状或半成型不黏肛便；稀便指水样黏肛便。 2.2.4  病理指标 灌药结束后，拉颈处死小鼠，打开腹腔，分离大肠，沿肠系膜附着部纵行剪开肠壁，冰生

10、理盐水冲洗干净，平展在放大镜下，观察结肠形态改变。肉眼观察 结肠黏膜出现的溃疡点、糜烂点、红肿、出血点； 病理切片观察 自病变严重部位取结肠组织标本约0.70.8 cm，置10甲醛液中固定，常规石蜡包埋，切片（5m），HE染色，镜下观察结肠的溃疡、炎症细胞浸润等病理学变化。2.5  统计学处理方法计数资料用卡方检验，计量资料用t检验。3  结果3.1  体征变化正常对照组，小鼠反应灵活，毛色光泽，喜活动，主动觅食、大便成小球状。模型组，造模5 h后，即排出稀便，随后逐渐加重，相继排出黏液脓血便；进食减少、体重减轻、消瘦、倦怠懒动、喜扎堆、拱背、竖毛、毛色无光泽、无

11、毛发自净习惯、精神萎靡。各给药组，先出现模型组所述症状，但随时间延长而有不同程度的改善，用药1 d后大便状态开始好转，进食量逐渐增加，体重增加明显，活动增多，给药3 d后毛色转荣，黏液便停止。3.2  结肠变化给药3 d后，处死小鼠，取结肠标本。模型组与空白对照组可见结肠黏膜明显充血、水肿、糜烂、出血灶，甚者可见大片黑褐色坏死组织，多个溃疡及糜烂面。用药各组上述症状明显减轻，愈合的结肠表面呈浅粉红色。记录结肠未愈溃疡的小鼠数以及溃疡点数。结果见表1。表1  给药后各组肉眼观察结果（略）各给药组与模型组、空白对照组比较，*P0.05；溃疡未愈小鼠数，各给药组间比较，P0.05

12、；溃疡点数，工艺3组与其他工艺组比较，P0.05；与阳性对照组比较，P0.05；n113.3  病理切片   正常对照组小鼠结肠皱壁规整，血管纹理清晰，未见糜烂和溃疡，黏膜上皮细胞排列整齐，肠线规则，杯状细胞丰富，间质未见水肿和充血。结果见图1。模型组小鼠可见肠黏膜上皮灶性坏死，脱落，黏膜及黏膜下层血管高度扩张，充血及出血；黏膜下层可见大量炎症细胞浸润，部分肠管全层坏死。结果见图2。图1  正常对照组（略）            

13、60;   图2  模型组（略）    空白对照组可见溃疡深达肌层，未见肉芽组织形成，溃疡邻近的肠黏膜上皮灶性坏死，脱落，黏膜及黏膜下层血管高度扩张，充血及出血；黏膜下层可见大量炎症细胞浸润，肠管全层坏死。结果见图3。阳性对照组与4个工艺组可见结肠黏膜上皮完整，未见坏死、脱落，腺管排列整齐；溃疡病灶已全部愈合或部分愈合，底部已有肉芽组织形成，上皮细胞增生并覆盖肉芽组织表面。结肠黏膜基本形态与正常对照组相似。结果见图45。图3  空白对照组（略）       

14、;       图4  阳性对照组（略）图5  工艺3组（略）4  讨论4.1  本文采用醋酸刺激法制作小鼠溃疡性结肠炎模型，其机理是利用醋酸的化学刺激造成结肠黏膜屏障结构破坏，继而产生炎症。该模型制作的关键是醋酸浓度和灌注剂量，本实验以5%醋酸（v/v），灌注0.1 ml。灌肠后小鼠表现为懒动、大便稀薄伴血性分泌物、体重减轻。1 d后处死小鼠，取出近肛门端3 cm左右的结肠，作病理组织学检查，可见黏膜表面有弥散性出血点、红斑和溃疡，上皮糜烂、坏死，黏膜下水肿及溃疡形成，可以确定造模成功。溃疡、

15、糜烂点是溃疡性结肠炎病人结肠镜下的重要病理表现，也是作为该病诊断及分期的依据之一3，该模型符合溃疡性结肠炎的病理特征。上述病理症状1周后自愈。醋酸刺激法造成的急性溃疡性结肠炎损伤模型，具有造模时间短、容易复制、结肠损伤（溃疡、糜烂、淋巴细胞浸润程度）明显的特点，适合新药的筛选研究。4.2  小鼠连续直肠灌药3 d后，各给药组小鼠的主要症状及体征变化均较模型组、空白对照组有明显改善（P0.05），腹泻、黏液便等症状减轻，体重增加明显。各给药组之间溃疡未愈的小鼠动物数无显著差异（P0.05）。结果提示，不同提取工艺所制得的复方黄芪肠宁提取物均具有明显的对抗醋酸诱导的炎性病理损害作用，能缓解局部炎症和改善机体状态，但工艺3所得提取物的疗效更好：粘膜水肿、充血、溃疡、糜烂症状明显减轻；溃疡点数最少，与其他工艺组存在显著差异（P0.05），与SASP组无显著差异（P0.05）；结肠皱壁及粘膜上皮完整，结肠粘膜内溃疡基本愈合，并形成瘢痕；有较多杯状细胞，黏膜下层只有少量炎症细胞浸润（淋巴细胞为主），其基本形态与正常组相似。4.3  中药复方制剂以多种成分发挥综合疗效，其中的一种或几种活性成分往往不能体现处方的药效，故仅仅以活性成分为指标筛选提取工艺有一定局限性。因此，在确定复方中药制剂的提取工艺时，可以先根据处方的药效，通过药理学实验，初步筛选提取工艺，在此基