核磁共振_质谱联用技术在药学领域的应用进展

1、NA representational difference analysis J .DNA Cell Biol ,2002,21(11:7712780.8Kmowles L M ,Milner J A.Diallyl disulfide induces ER K phos 2phorylation and alters gene expression profiles in human colon tumor cellsJ .J Nutr ,2003,133(9:290122906.9Chung J G ,Lu HF ,Yeh CC ,et al .Inhibition of N 2acet

2、yltrans 2ferase activity and gene expression in human colon cancer cell lines by diallyl sulfide J .Food Chem Toxicol ,2004,42(2:1952202.10王玉英,程何祥,张殿新,等.Ang 对人心房细胞内游离钙浓度的影响及大蒜素的拮抗作用J .心电学杂志,2005,24(2:84286.11史春志,谷翔,冯义柏,等.大蒜素对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的药物预适应及抗凋亡作用J .中华实用中西医杂志,2005,18(14:3202323.12蔡飞,李彩蓉,吴基良,等.大蒜素对

3、大鼠局灶性脑缺血后热休克蛋白的影响J .医药导报,2005,24(3:1832184.13郑燕华,陈崇宏.大蒜素对大鼠急性脑缺血再灌注损伤保护作用的研究J .中国药理学通报,2004,20(7:8212823.14刘浩,崔美芝,董娟.大蒜素抗氧化延缓衰老作用的实验研究J .中国老年学杂志,2006,26(2:2522253.15Bakri IM ,Douglas CWI.Inhibitory effect of garlic extract on o 2ral bacteria J .Archives of Oral Biology ,2005,50(6:6452651.16张志勉,高海青,魏

4、瑗.大蒜素对肿瘤患者细胞免疫功能的影响J .山东大学学报(医学版,2003,41(2:1482150.17汪燕,刘艳,史载祥,等.大蒜素脂质体的研制及其质量评价J .中日友好医院学报,2005,19(3:1612163.18敦洁宁,邓树海,苗彩云,等.大蒜素壳聚糖微球的研究J .山东大学学报(医学版,2005,43(5:4522454.19徐巍,邓树海,李艳辉.大蒜素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备工艺研究J .中国新药杂志,2006,15(6:4482451.20蒋慧,刘斐.高效液相色谱法测定大蒜素注射液中大蒜素的含量J .中国药业,2005,14(2:43.21黎维勇,吴波,宋波.固相微萃取

5、2气相色谱法测定大蒜素注射液的含量J .中国药科大学学报,2005,36(1:90291.收稿日期2006209222作者简介骆泽宇,男,大学,主管药师,电话:139*核磁共振2质谱联用技术在药学领域的应用进展骆泽宇(柳州市人民医院药剂科,广西柳州545001摘要目的:介绍液相色谱2核磁共振2质谱(L C 2NMR 2MS 联用技术的基本原理及其在药学领域的应用进展。方法:查阅国内外文献和相关资料,选取有代表性的文献进行综述。结果:阐述了L C 2NMR 2MS 的仪器构造、工作模式、技术重点,及其在生物体内代谢物和天然产物结构鉴定方面的典型应用。结论:L C 2NMR 2MS 作为一项新的分

6、析手段,逐渐成为药学领域中化合物结构鉴定的强有力武器,得到越来越广泛的应用,具有巨大的发展前景。关键词液相色谱2核磁共振2质谱;代谢物;天然产物中图分类号R 927文献标识码B 文章编号100125213(20070620807203在药学研究领域,如何快速准确的对化合物作结构鉴定是众多研究工作者所面对的共同难题。液相色谱2质谱联用技术(L C 2MS 和核磁共振光谱(NMR 是两种较为突出的技术手段,但在单独使用时都具有一定的局限性。而液相色谱2核磁共振光谱2质谱联用系统(L C 2NMR 2MS 在单独的L C 分离后,同时获得MS 和NMR 数据。MS 对化合物进行快速扫描,提供初步的结

7、构信息;NMR 作为辅助,进行详细的结构解析,提供了一种实时复合矩阵分析的模式122。本资料对L C 2NMR 2MS 联机在线分析系统的仪器构造、技术发展等做了一个全面的概括,并且详细阐述了近10年来该技术在药物代谢物和天然产物结构鉴定方面的应用。1仪器介绍1.1L C 2NMR 2MS 联用系统的构造L C 2NMR 2MS 系统分为并联和串联两种模式。并联模式将L C 洗脱液分为约201两部分,大部分直接进入NMR 流动液槽探针,剩余少量进入MS 离子源接口。该模式既能同时满足NMR 的检测灵敏度要求和MS 响应,也可避免L C 2MS 接口处产生的负压损坏NMR 探针。待测物可同时被两

8、个系统检测或选择性被其中一个所检测。串联模式则使样品先经NMR 分析后通过一个分流装置,再进入MS 检测。该模式所需时间长,增大了样品峰扩散和保留时间漂移的可能性。但其可将MS用作单独的质谱分析而不会影响NMR 检测,常用于连续流动模式的NMR 检测。安装仪器时,所有检测器都应位于距NMR 探针磁场区域5个高斯线之外,因为高磁场会大大减弱各种检测器的响应和灵敏度,尤其是MS 检测器。1.2L C 2NMR 的工作模式L C 2NMR 系统主要有两种工作模式:连续流动模式和停止流动模式。连续流动模式是让L C 洗脱液以一定速率连续进入NMR 流动液槽探针,获得一系列连续的光谱数据。该模式下NMR

9、 数据采集时间有限,因此要求样品组分有较高的响应。可通过降低流动相流速,增加测量时间来提高检测灵敏度。随色谱峰在流动液槽中位置不同,停止流动模式又分为直接停流模式和循环储存模式。直接停流模式是在目标色谱峰最高点进入NMR 流动液槽中心位置时,流动相停止并进行NMR 采样,是目前应用最多的一种模式,但使用时可能因流动相停止而造成色谱峰扩散和响应减弱,以及高浓度物质引起的记忆效应。循环储存模式则将L C 分离后的色谱峰储存在毛细管回路中,至分离全部完成后再进行NMR 检测。该模式不中断色谱过程,并且可对各个色谱峰按任意顺序进行检测。但一些成分可能因长时间储存发生降解或者异构化,影响结果准确性。停流

10、模式下NMR 属于静态检测,数据采集时间可随待测物浓度作相应的调整,对于一些质谱响应弱的待测物,如药物体内代谢物、生物标记物、毒性物质及天然提取物等尤为适用。1.3停流模式监控在单独的L C2NMR系统中使用停流模式时,常用紫外(UV或荧光检测器来控制液相泵的启动和停止,或将L C流出液片断临时保存到样品储存单元中,但其局限性在于许多化合物并无紫外吸收或荧光。现今已有较为完善的MS光谱数据库和化合物结构数据库,帮助研究者根据样品中各成分相对分子质量和裂解碎片快速选择目标色谱峰,再经反馈的MS信号控制液相泵的停止和色谱峰片断的储存。因此L C2NMR2MS常采用并联结构,并且选择与NMR探针体积

11、匹配长度的毛细管来连接MS2NMR是该技术的关键。1.4NMR探针技术流动液槽探针是影响NMR灵敏度的主要部件,其决定参数为直径和体积,与待测样品量和色谱峰面积有关。除普通探针外,相继出现的冷冻探针、螺线管探针等都有其独特的优越性。冷冻探针的原理为当电子元件降为-20K低温时样品仍处于室温状态,此时电子噪声显著减弱。与普通探针相比,可将灵敏度提高34倍。螺线管探针最大的优点在于其可以提供耦合常数信息,但每根毛细管柱都需匹配一个电磁线圈,成本增加,且电磁线圈与样品太过接近也可能造成谱线变宽或分辨率减低。另有一种特殊的13C流动探针,将电磁线圈直接安装在玻璃管上,外面再放置一个同轴电磁线圈。该探针

12、可以削弱1H/1H耦合,并且使固定频率变得稳定,可在连续流动模式中获得普通探针难以得到的13C NMR光谱数据。1.5流动相的兼容性和溶剂抑制流动相是影响L C2 NMR2MS性能的另一重要因素。常用的两相混合流动相中,往往因水中1H质子NMR信号太强而使样品信号淹没在溶剂噪声中无法测得。无机盐缓冲液和氘代有机溶剂可以解决这个问题,但无机盐缓冲液不可用于ESI2MS(电喷雾离子源质谱中,氘代溶剂价格昂贵,因此实际常用非氘代的甲酸、醋酸、三氟醋酸(TFA以及相应的铵盐。当L C2SPE (固相萃取2NMR技术发展起来后3,只需在将待测物从SPE小柱上洗脱到NMR流动液槽的过程中使用氘代溶剂,而在

13、L C色谱分离时使用非氘代流动相,解决了氘代溶剂的高昂成本问题。也可采用溶剂抑制技术来解决溶剂信号对分析的阻碍问题,一般有3种途径:(1不同频道多重预饱和;(2激发脉冲序列照射;(3WET梯度场相位离散。预饱和常用于停止流动模式中,而WET更适用于连续流动模式。但多重溶剂抑制可能导致大量有用的NMR信息丢失,可采用部分氘代溶剂或同时使用两种独立的溶剂体系,由于两者被抑制区域不同,综合后即得到全面的1H光谱数据。2L C2NMR2MS在药学领域的应用2.1在代谢物分析方面的应用生物样本中的药物代谢物分析在新药研究和临床用药监控方面起着极为重要的作用。一般来说,用NMR进行药物代谢的研究有以下条件

14、:(1待测物分子中需含有具核磁矩的核素;(2这些核素在生物转化过程中不易脱下;(3由于核磁共振仪灵敏度的限制,待测物给药剂量应较大;(4药物给药后的较短时间内代谢,且代谢物的量满足检测限要求。1995年,Pullen等使用第一台L C2NMR2MS系统,尝试性的从混合物中分离并鉴定一个有着两个相连三唑环结构的氟化物,取得了成功。后Connelly等人将2,32苯并呋喃(BF经大鼠腹腔给药后一定时间收集尿液,鉴别其代谢产物4。该实验的关键是先获得MS数据,再对NMR做指导性检测,通过MS的快速分析获得特定的分子质量和离子碎片信息,其检测对象为BF硫酸化的代谢产物,证明了不含核磁矩核素的化合物也可

15、以通过L C2NMR2MS系统鉴定其结构。目前的文献报道中,对对乙酰氨基酚体内代谢物的研究工作较为系统和全面。1996年,Shockcor等对对乙酰氨基酚在人尿液中的代谢产物进行检测5,以乙腈2重水混合体系做反相梯度洗脱,经UV检测器后分流,ESI离子阱质谱作阳离子检测,另以一选择性正弦脉冲装置作溶剂抑制。结果表明,除预期的药物代谢产物结构得以确定外,还检测到了一些不易在人尿液中发现的内源性代谢物。之后,Burton 等用相似的液相分离条件对同样的对乙酰氨基酚生物药物样本进行分析6。选择WET溶剂抑制技术,在连续流动模式下获得1H NMR光谱数据,并以单四极杆质谱仪同时对正负离子进行检测。冷冻

16、探针技术出现后,Spraul等仍以对乙酰氨基酚的人尿液代谢产物为分析对象,与早前报道的普通探针检测结果比较,使用冷冻探针的检测灵敏度大幅升高7。L C2F T/IR(傅立叶红外2TOF/MS(飞行时间质谱2 NMR多重联机系统的出现将L C2NMR2MS带入了一个新的阶段。由于各检测器对化合物响应强度不同,检测限也不同,通常需要对流动相进行多次分流来避免UV和MS的超载问题。这种联用模式为样品中主要成分和杂质的结构鉴定提供大量信息,使分析更为快速准确。Louden等人以非甾类化合物为例,对此新系统的适应性做了考察8。L C2SPE2NMR2MS系统也是该领域的一项重要技术,可在冷冻探针的基础上

17、,再次提高检测灵敏度。G odejohann等人将该系统用于人尿液中对乙酰氨基酚的微量浓度代谢物的结构鉴定9,结果证明,当待测物浓度很低、量很少时,该系统是最有效的分析手段之一。通常认为,加热的重水是L C2NMR2MS系统最理想的流动相,其优势在于:(1相对于其他氘代有机溶剂来说价格便宜;(2杂质少,纯度高;(3基线噪声极小,且可以选择性将目标待测物中部分活泼质子氘代,以获得清晰的1H NMR 信号。Smith等人以水杨酰胺和一系列磺胺药物为样品作了深入研究,随后又将此体系用于维生素类药物的检测10,均证明了这一点。基于L C2NMR2MS联用检测系统的巨大优越性和发展潜力,科研者们在该领域

18、做了大量实验工作,已报道的化合物有:布洛芬(ibuprofen在人体尿液中的代谢产物,22氯242三氟苯甲铵、22溴242三氟苯甲铵和胡椒碱在大鼠尿液中的代谢产物11,HIV21逆转录酶抑制剂的代谢产物12等等。此外,也有文献报道将该技术用于糖苷类和氨基酸类化合物的检测13。Sandvoss等对该系统近年来在药物代谢物检测方面的应用作了较为详尽的研究14。2.2在天然产物结构鉴定方面的应用绝大多数药品和功能性食品的主要成分都是直接存在于自然界中的天然化合物,对天然产物化学结构的分析和鉴定提出了更高的要求。Wilson等将L C2NMR2MS用作蝇子草提取物中脱皮素的结构鉴定,这是L C2NMR

19、2MS首次被应用在天然产物方面15。实验以1H213C流动液槽探针NMR与ESI离子阱质谱并联,在连续流动模式下获得所有峰数据,再针对目标峰进行停流模式检测,并对流动相采用WET溶剂抑制。G il 等在对啤酒、葡萄酒提取液中芳香化合物的检测实验中16,使用1H213C反检测流动探针,顺利实现了对样品中芳香化合物的检测。Wolfender等以古柯科植物为原料,对其中的托品类生物碱成分进行了检测;并且使用柱前衍生化技术与L C2NMR2MS系统联用,鉴定了子菜科植物提取物中的多种极性化合物成分,成功分离出了其中的新成分17。大量实验证明,L C2NMR2MS联用系统在多种天然产物成分的结构鉴定方面

20、效果卓著。较之临床样品,天然产物的成分更加复杂,分离更加耗时耗力。L C2NMR2MS系统与SPE技术联用,在目标峰进入NMR检测之前对其进行浓集,避免了繁复的样品前处理问题。3展望综上所述,在线L C2NMR2MS联用系统是鉴定化合物结构的一个有效手段,能够解决许多单用L C2MS或L C2NMR 无法解决的问题,并且不需要对样品进行复杂的分离和提纯。特别是近年来冷冻探针技术、微探针技术、流动相抑制技术等先进技术的发展,使得L C2NMR2MS检测灵敏度大大增加,应用领域也更加广泛,尤其是在生物医学和药学方面,对生物样本分析、药物体内代谢过程研究、天然产物结构鉴定等等,取得了不错的进展。由于

21、3种仪器联用本身需要比较高的成本和一些技术条件的限制,目前国内以其为手段的相关研究较少,研究工作者们还需要对相关的仪器和专业软件进行更深入的学习和应用,让这种先进的技术更好的为我国医药事业服务。参考文献:1司伊康.核磁共振谱技术在药物代谢研究中的应用J.药学学报,1997,32(3:2362240.2安登魁.现代药物分析选论M.北京:中国医药科技出版社,2001.2442498.3Sandvoss M,Bardsley B,Beck TL,et al.HPL C2SPE2NMR inpharmaceutical development:capabilities and applications

22、J.Magn Reson Chem,2005,43(9:7622770.4Connelly J C,Connor SC,Monte S,et al.Application of di2rectly coupled high performance liquid chromatography2NMR2 mass spectometry and1H NMR spectroscopic studies to t he in2 vestigation of2,32benzofuran metabolism in sprague2dawley rat sJ.Drug Metab Dispos,2002,

23、1(30:135721363.5Shockcor J P,Unger SE,Wilson ID,et al.Combined HPL C,NMR spectroscopy,and ion2trap mass spectrometry wit h ap2 plication to t he detection and characterization of xenobiotic and endogenous metabolites in human urineJ.Anal Chem,1996, 68(24:443124435.6Burton KI,Everett J R,Newman MJ,et

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26、ss spectrometry:application to a mixture of nonsteroidal antiinflammatory drugsJ.Anal Chem,2000,72:392223926.9G odejohann M,Tseng L H,Braumann U,et al.Characteriza2tion of a paracetamol metabolite using on2line.L C2SPE2NMR2 MS and a cryogenic NMR probeJ.J Chromatogr A,2004,26 (122:1912196.10Chient h

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28、opean J Phar Sciences,2003,19(5:4132421.12Shockcor J P,Unger SE,Savina P,et al.Application of direct2ly coupled L C2NMR MS to t he structural elucidation of metab2 olites of t he HIV21reverse2transcriptase inhibitor BW935U83 J.J Chromatogr B,2000,748(1:2692279.13Ramm M,Wolfender JL,Queiroz EF,et al.

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