2002年全国中学生生物奥赛教练员培训班分子生物学...

1、2002 年全国中学生生物奥赛教练员培训班一一分子生物学专题分子生物学基础理论DNA 复制基因转录蛋白质生物合成基因表达的调控基因工程专题内容（一）复制、转录、翻译（二）基因表达调控（三）基因工程（一） 复制、转录、翻译遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA 分子上，表现为特定的核苷酸顺序，并通过DNA 复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育中，遗传信息通过DNA 转录成 RNA，然后由 RNA 翻译成特定的蛋白质，通过蛋白质执行各种生命功能，将生命的遗传特征体现出 来。1 DNA 复制DNA 复制是指以亲代 DNA 分子的两条链为模板合成各自的互补链，形成两个子代 DNA分子的过程。复制的过程

2、是半保留模式和不连续的。复制过程是由一系列酶和蛋白质参与的。复制开始时，亲代双螺旋 DNA 链首先必须解开螺旋，成为两条独立的单链分子，以作 模板之用，催化完成这步反应的主要是解螺旋酶，Rep 蛋白帮助解开双螺旋。解开的两条单链随即被单链结合蛋白所覆盖，作用是阻止单链本身折叠配对形成双链DNA，并保护单链部分不被核酸酶降解。 DNA 复制过程中担任 DNA 合成的酶是 DNA 聚合酶，只能从 5宀 3 的方向逐个连入核苷酸。因此只能利用35 方向的模板链合成子链，合成方向为5宀 3,称为前导链。由于亲代 DNA 双链中只有一条链的方向为 3 T5 ,故另一条链 （5T3 ）的复制只能先合成多个

3、小片段DNA （称为冈崎片段），然后连接成长的链，称为滞后链。合成冈崎片段之前需由引物合成酶先合成一小段RNA 引物。在此引物 3 -OH端由 DNA 聚合酶 III 沿 5T3 的方向催化合成小的冈崎片段。之后由 DNA 聚合酶 I 切除RNA 引物，并填补修复缺口。最后由DNA 连接酶将多个小片段 DNA 连接成长链。而 3 T5方向的模板链可以在一个引物上连续进行5 T3 方向的链合成。而模板链可以在一个引物上连续进行 5T3方向的链合成。DNA 复制所需的酶和蛋白质酶和蛋白质作用拓扑异构酶帮助解开复制叉前后的超螺旋结构DNA 解螺旋酶解开超螺旋Rep 蛋白帮助解开双螺旋引物合成酶合成

4、RNA 引物单链结合蛋白稳定单连区DNA 聚事酶 III合成 DNADNA 聚合酶 1消除引物，填满裂隙DNA 连接酶连接 DNA 末端2 基因转录及转录后加工转录是以 DNA 为模板，在 RNA 聚合酶作用下合成 RNA 的过程，是遗传信息从 DNA 向 RNA 传递的过程，是遗传信息表达的第一步。转录单位是指RNA 聚合酶作用的起始点与终止点之间的 DNA 顺序；启动子是 DNA 分子上可与 RNA 聚合酶特异性结合， 而使转录 开始的一段DNA 序列；增强子是包括启动子上游与启动子重叠的一段DNA 序列，使启动子发动转录的能力大大增强。转录终止信号使 mRNA 从转录复合物上释放出来而终

5、止转录。DNA 指导的 RNA 聚合酶在 RNA 合成中起催化作用。可以识别DNA 分子中起始区的启动子，使 DNA 部分双螺旋解开，解开长度为17bp，从而产生单链 DNA 模板，并选择正确的核糖核苷酸催化形成磷酸二酯健。能识别转录终止信号， 并可与调节转录的活化蛋白或阻遏蛋白作用，从而对基因的表达起调控制作用。转录起始时，必须有一些蛋白质因子参与，称为转录因子，作用是帮助 RNA 聚合酶结合到启动子上。 包括：TF2D、TF2A、TF2B、TF2H、 TF2E、TF2H 等。转录起始时，RNA 聚合酶识别结合启动子，并解除启动子区域双螺旋结构，解开的以 链相当于 17个碱基对，开始催化合成

6、 RNA。转录延长阶段，RNA 聚合酶沿模板 3 宀 5 方向移动，并按模板的碱基序列，配对加入四种核苷酸，进行RNA 的聚合。RNA 的合成方向沿着 53方向进行。酶前面的 DNA 双螺旋不断解开，后面的 DNA 重新回复到双螺旋结构，同时 RNA 链也不断地从 RNA-DNA 杂交体中分离出来。转录终止时，RNA 聚合酶停止作用，RNA 合成终止。新生的 RNA 链释放，局部解开的 DNA 回复到双螺旋结构， 酶从模板上释放出来。转录过程即告结束。转录后加工：按照 DNA 模板转录生成的 RNA 链经过修饰、切除和拼接等反应，去除 非编码序列，形成成熟的、具有功能的RNA 分子，这一过程称

7、为 RNA 转录后加工。原核生物的 mRNA 不需要修饰加工，在它的 3端尚未完成转录前，其 5端已与核糖体结合， 开始蛋白质的合成，即转录与翻译偶联。真核生物的转录在细胞核内进行，而翻译过程在细胞质中进行，转录和翻译在时间和空间上是分开的。真核生物的 mRNA 在细胞核中合成后，还必须经过一系列的加工处理，才能到达细胞质中指导蛋白的合成。转录后加工包括：5端加帽，即新合成的 mRNA 的 5 端与第 7 位碳原子被甲基化了的鸟嘌呤核苷酸在酶的作 用下相连的过程，有提供核糖体的识别位点和使mRNA 避免受到磷酸酶和核酸酶的攻击等作用。3端加多聚腺苷酸尾，即在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，在mRNA

8、 的 3端连接多聚腺苷酸（polyA ），具有增加 mRNA 的稳定性和增加翻译效率的功能。mRNA 前体的剪接，大多数真核基因都是由蛋白编码序列和非编码序列组成，编码序列称为外显子， 非编码序列称为内含子。外显子往往被内含子隔开，形成相间排列方式。 在基因转录中，内含子和外显子同时被转录，产物为 RNA 前体。在形成成熟的 mRNA 时，内含子被切除，外显子被顺序 连接，称为剪接。因此，基因在转录为 RNA 前体后，还必须经这样一系列的加工处理，才能到达细胞质中指导蛋白的合成。3蛋白质的牛物合成蛋白质的生物合成是存在于 mRNA 中且由碱基序列决定的遗传信息被表达为蛋白质的 过程。参与蛋白质

9、合成的元件主要有mRNA、tRNA、核糖体。mRNA 携带遗传信息，是蛋白质合成的直接模板，tRNA 转运特异性氨基酸进行蛋白质的生物合成，核糖体是蛋白质合 成的场所。一个核糖体有两个 tRNA 位点：P 位点和 A 位点。携带新生肽的 tRNA （肽酰 tRNA ） 占据 P 位点，新进入的携带氨基酸的 tRNA （氨酰 tRNA ）结合在 A 位点。新进入的氨酰 tRNA 的反密码子与 mRNA上的密码子配对，结合在 A 位点。核糖体的组分催化肽酰tRNA 携带的多肽被转移至氨酰 tRNA 所携带的氨基酸，肽健形成。P 位点上的 tRNA 卸下肽链而成为无负载的脱酰 tRNA。一个新生的肽

10、酰 tRNA 在 A 位点形成。在前一个肽链的基础上长一个氨基酸残基。核糖体沿着 mRNA 移动一个密码子的距离，即转位。使脱酰 tRNA 移出 P 位 点，新的肽酰 tRNA 移入 P 位点。待转译的下一个密码子正位于A 位点，准备让下一个新的氨酰 tRNA 进入。脱酰 tRNA 离开核糖体，转运新的氨基酸。此合成周期循环重复，至加 入最后一个氨基酸。核糖体识别终止密码子，释放已合成完毕的肽链，核糖体同mRNA 分离，蛋白质合成结束。(二)基因表达调控现已揭示细菌基因组有 4000 个基因，人类基因组有 30 000 个基因，但其中只有一部分 基因在特定的时间内表达。 在多细胞真核生物的发育

11、过程中， 某些影响细胞分化的蛋白仅在 某种细胞中存在很短一段时间。各种具有不同功能的细胞所表达的基因产物也有很大差别。一个典型的例子就是红细胞中需要绝对高浓度的血红蛋白，而其他体细胞中则不是这样，成熟的红细胞中血红蛋白基因呈现高水平表达，产生的大量血红蛋白满足了红细胞运输氧和二氧化碳的功能。这里就有一个基因的调控问题。基因表达由一定的调控机制决定，呈现一定的时间顺序和空间顺序。在多细胞生物的生长发育过程中，相应的基因按一定的时间顺序开启或关闭，决定细胞向特定的方向分化和发育。多细胞生物同一基因产物在不同的组织器官中的分布是不同的，某些基因在一种组织细胞中暂不表达或永不表达， 而另外一些基因则可

12、能是相反的情况。任何影响转录核翻译过程的启动、关闭和速率的较为直接的因素及其作用，叫做基因表达的调控。1.基因表达调节模式根据调控蛋白对 RNA 聚合酶活性调节可将基因表达调控分为正调控和负调控。正调控 是指激活物结合到启动子附近从而增强RNA 聚合酶的结合与活性。激活物与信号分子的相互作用既可导致转录的增强也可导致转录的减弱。有时信号分子的作用使结合在 DNA 上的激活物脱落，转录停止；有时信号分子的作用使激活物结合在DNA 上，转录得以进行。负调控是指阻遏物结合到启动子附近而阻遏RNA 聚合酶与启动子的相互作用。阻遏物与信号分子的相互作用既可导致转录的增强也可导致转录的减弱，某些情况下，信

13、号分子与结合在DNA 上的阻遏物作用，构象的变化使结合在DNA 上的阻遏物脱落，转录得以进行；有时，信号分子与非活性状态的阻遏物相互作用使阻遏物结合到DNA 上，阻遏转录的进行。2 原核基因表达调控(1 )原核基因结构和表达调控元件的特点原核生物是较为简单的生物体系，它们的基因组成较真核生物简单。原核生物的基因组仅包含一条染色体。 基因是连续的，没有内含子，而且绝大部分基因编码蛋白，只有小部分 不翻译。几个功能相关的基因成簇地串联排列于染色体上，共同组成一个转录单位，受同一个启动基因控制，组成的基因表达调控单元，叫做操纵子，原核生物的一个转录单位编码多条肽链。以操纵子为调控单位进行的转录调控是

14、原核基因表达调控的基本方式。此外，原核基因的转录和翻译是偶联的，几乎在转录的同时翻译过程也在核糖体中进行。(2 )原核基因表达调控方式一一乳糖操纵子模型通过代谢物调节基因活性是原核基因最普遍的一种调控方式，是指在一些代谢物的作用下，通过一些调节蛋白的作用，使基因活化或阻遏。 其中最突出也是研究最早的一个例子便是大肠杆菌的乳糖操纵子模型。在含有葡萄糖和乳糖的培养基中，细菌优先利用葡萄糖作为能量来源。在只有乳糖的培养基中，细菌的生长在开始阶段不好，但过一段时间后，在乳糖的诱导作用下，细菌就可以表达出分解和利用乳糖的酶：3-半乳糖苷酶一将乳糖转变为异构乳糖；3-半乳糖苷透过酶协助乳糖分子透过细胞膜进

15、入胞内；3-半乳糖苷乙酰基转移酶。控制这三个基因表达的调控单元就是乳糖操纵子，包括：3 个结构基因 z、y、a,分别编码3-半乳糖苷酶、3-半乳糖苷透过酶、3-半乳糖苷乙酰基转移酶；操纵基因o,是阻遏蛋白的结合位点，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，lac mRNA 的转录受阻；调节基因 i，编码阻遏蛋白，可与 O 基因 结合；启动基因 p，位于 i 和 o 之间。在培养基中没有乳糖存在时，i 基因编码的阻遏物结合在 o 区，结合到启动子 p 区的 RNA 聚合酶便不能越过 o 区到达结构基因区进行转录，lac 操纵子处于阻遏状态。但即便在阻遏状态，lac 操纵子也存在本底表达，每个细胞中可能有几个

16、3-半乳糖苷酶及透过酶生成。当有乳糖存在时，在单个透过酶分子作用下，少量乳糖 分子进入细胞，又在单个3-半乳糖苷酶分子作用下转变为异构乳糖，而异构乳糖是 lac 操纵子的诱导物。异构乳糖与阻遏物结合后，使阻遏物失活，这样转录开始。这些mRNA 翻译出大量的3-半乳糖苷酶和透过酶，使大量的乳糖进入细胞，从而使 lac 操纵子更大限度地去 阻遏，产生更多的可以分解代谢乳糖的酶。3.真核基因表达调控真核生物与原核生物在基因表达调控上最主要的区别在于原核生物只要通过转录调控 来开启或关闭某些基因的表达以适应环境条件的变化，而对大多数真核生物来说，基因表达调控最明显的特征是能在特定的细胞中激活特定的基因

17、，从而实现有序的、不可逆转的分化发育过程，并使特定的组织和器官行使不同的功能。真核生物基因表达调控的复杂性和特殊性是由其自身的基因结构的特殊性、基因组的特点以及真核细胞的复杂性决定的。(1 )真核基因结构和表达调控元件的特点真核生物的基因组十分庞大， 而有编码功能的基因只占全部基因组的一小部分。大部分基因组 DNA 不具有直接的遗传学功能，很可能在基因复制或基因表达中起调节作用，真核 生物 DNA 中含有大量重复序列。真核生物的基因组有内含子，体现了真核基因的不连续性。 内含子和外显子共同被录，然后在形成成熟的mRNA 时，内含子被切除，外显子被顺序连接，称为剪接。对于同一个初级转录本，不同的

18、剪接方式产生不同的mRNA，可翻译成不同的多肽，因此初级转录产物的剪接过程是真核基因表达调节的一个重要环节。真核生物的一个基因对应于一条 mRNA，只编码一条多肽链。此外，转录和翻译在时间和空间上是分 离的，转录在细胞核内进行，翻译在细胞质中进行。(2) 真核基因表达是多级调控从基因的活化到蛋白质的合成与分解，有多个环节可以作为控制点，包括：转录前水平的调控、转录水平的调控、转录后水平的调控、翻译水平及蛋白质加工水平的调控。其中， 基因在转录水平上的调控是一个最主要的控制点。转录前水平的调控：通过改变 DNA 序列和染色质结构从而影响基因表达的过程均属于 转录前水平的调控。包括：染色质的丢失、

19、基因扩增、染色质DNA 序列的重排、染色质DNA 的修饰和异染色质化等方面。转录发生之前，染色质会在特定的区域被解旋或松驰， 形成自由的DNA，这些变化将导致结构基因的暴露，以使RNA 聚合酶有效地结合到 DNA模板上，并沿着模板 5宀 3方向进行转录。因此，被转录基因的染色质结构要经历一个 构象的变化，进入一个“活化”状态。转录水平的调控：真核生物基因的表达调控除涉及到启动子、RNA 聚合酶活性的调节及调节蛋白外，还涉及增强子等DNA 元件以及更多的转录调节因子。转录因子通过与启动子或增强子结合，改变 DNA 的构象，影响基因转录。没有大量的转录因子，RNA 聚合酶不可能识别真核生物数量巨大

20、的启动子。转录起始调控是目前研究最为精细也是机体所采取的 最普遍的基因表达调控方式，是调控的基本控制点。转录后水平的调控：真核生物的基因转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质中进行， 这种转录和翻译过程的时空差别使得基因转录后的调控成为真核基因区别于原核基因表达 调控的一个重要方面。真核基因经过转录首先形成初级转录本，然后经过5端加帽、3 端的加尾、剪接等加工后才成为有功能的RNA 分子，被认为是产生蛋白质多样性的分子机制之一。翻译水平及蛋白质加工水平的调控：翻译水平的调控主要是控制mRNA 的稳定性和有选择地进行翻译，是一种快速调控基因表达的方式。翻译后加工指多肽链合成后通常需经过加工和折叠后

21、才能成为有活性的蛋白质。包括蛋白质及多肽的切割加工、多肽的化学修饰(糖基化或磷酸化)以及多肽的剪接等过程，使蛋白成为有生物活性的分子。一种翻译产物经过 不同的加工过程可形成不同活性的产物，这种后加工过程在基因表达的调控上起重要作用。(三)基因工程基因工程作为分子生物学中的核心成分，已渗透到生命科学研究的每一学科。在农业、 工业、环保业、医药业等领域取得了令人瞩目的成就。在医学方面，基因工程药物、基因工 程疫苗、基因工程抗体、转基因动物的问世，为人类疾病的诊断和治疗作出了重大贡献。自从 1953 年 Watson 和 Crick 阐明了 DNA 的双螺旋结构以来，生物学的发展进入了一 个全新的阶

22、段，即跨入了分子水平。在50、60 年代科学家们确立了 DNA 复制、重组修复、遗传信息传递机制的中心法则及有关遗传密码等分子遗传学理论；发现了诸如限制性核酸内切酶、连接酶等一系列工具酶；在技术上又发展了DNA 纯化与鉴定等，从而为基因工程学科的建立奠定了基础。1973 年，Cohen 等人将带有四环素抗性表型的质粒pSC101 和带有新霉素抗性的质粒 R6-3 分别用 EcoR1 酶切后，在体外将二者连接起来，然后将产物导入大肠 杆菌，成功地进行了无性繁殖，并得到了既抗四环素又抗新霉素的大肠杆菌，从而完成了 DNA 体外重组和扩增的全过程，基因工程这门新兴学科也就应运而生。基因工程是指在体外

23、条件下，人工将DNA 分子剪切并重新拼接，形成一个新的杂合的DNA 分子，然后将它导入微生物或真核细胞内，使该分子得到无性繁殖，并可使该基因在 细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物或改造、创造新的生物类型。 基因工程所采用的基本技术被称为 DNA 体外重组技术，也称为基因克隆或分子克隆技术。1 基因工程的基本程序(1) 目的基因的 DNA 片段的带有获得；(2) DNA 片段与载体 DNA 的连接，即体外重组；(3) 连接产物导入宿主细胞；(4) 重组体的扩增、筛选与鉴定；(5) 目的基因在细胞中的表达；(6 )表达产物的分离、鉴定等。2.基因工程工具酶基因工程工具酶是进行基因工程操作必不可

24、少的工具。包括：限制性核酸内切酶和核酸修饰酶。限制性核酸内切酶主要来源于原核生物，具有识别自身 DNA 和异源 DNA 的功能，通过切割破坏或限制异源 DNA 分子侵入宿主细胞来保护自身。分为I、II、III 型，常用的是 II 型。为获得适用于不同目的的核到片段，如DNA 片段间的连接、粘性 DNA 片段的补平或削平、DNA 序列测定、聚合酶链反应等，基因工程中还经常用到核酸修饰酶。限制性核酸内切酶识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链DNA ,识别顺序最常见的是 4-6 个核苷酸，多为回文对称序列。有两种切割方式：当它切割双链 DNA 时，若切割部位在识别序列的中心轴，产生

25、平末端；不在中心轴，产生带有单链突出 端的 DNA 片段，称为粘末端。某种 DNA 分子的限制酶位点数目和排列顺序图谱称为限制 性内切酶图谱，是基因操作的重要基础。在基因工程操作中，必须首先了解限制性内切酶在目的基因和载体 DNA 上的位置和数目，才能利用合适的酶切位点进行DNA 重组工作。核酸修饰酶的特性及应用名称特性应用甲基化酶与限制性内切酶组成限制-修饰系统，使 顺序中某个碱基甲基化保护自身 DNA 不被切开连接酶催化双链 DNA 中相邻的 5磷酸基团 与 3 羟基之间形成磷酸二酯键连接具有粘性末端或平末端 的两个 DNA 片段，成为一个 重组分子聚合酶以 DNA 或 RNA 为模板在体

26、外合成DAN 或 RNA合成一个基因或一个片段，制备 DNA 或 RNA 探针Taq 酶耐热的 DNA 聚合酶，具有 5 -3 聚合 酶活性，缺乏 3 -5 外切酶活性PCR 反应核酸酶是一类降解核酸的酶缺口平移法标记探针、制备DNA、RNA 等碱性磷酸酯酶催化水解 DNA、RNA 的 5磷酸基团防止载体自身连接环化等综上所述，基因工程工具酶就象是外科医生的手术刀一样，是进行基因工程操作必不可少的工具。为便于目的基因与载体之间的连接，应根据它们各自的特点和功能，选择适当的限制性核酸内切酶切酶切割DNA，或利用核酸修饰酶再对这些酶切后的片段进行处理，从而为 DNA 体外重组打下基础。3载体载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达和复制的运载工具， 常用的有质粒、噬体和病毒。质粒和噬菌体用于原核细胞为宿主的分子克隆；动物病毒用于真核细胞为宿主的分子克