蛋白质的分离纯化剖析

1、 第一节第一节 引言引言n蛋白质存在于一切生物体中蛋白质存在于一切生物体中,是非常重要的是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者,担负着生物催化、物质运输、运动、防御、担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。调控及记忆、识别等多种生理功能。 第二章第二章 蛋白质分离纯化原理与技术蛋白质分离纯化原理与技术一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质从生物材料中分离制备蛋白质,研究其结构与研究其结构与功能功能,对于了解生命活动的规律对于了解生命活动的规律,阐明生命现象阐明生命现象的本质有重大意义。的本质有重

2、大意义。工业生产的需要工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等食品、发酵、纺织、制革等工业工业,需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病。如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要基因工程的需要二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求1 1、纯度、纯度: :主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构为研究蛋白和一级结构、空间结构, ,一级结构与功能的一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶

3、和标准蛋白、酶法分析的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂酶制剂, ,都要求均一都要求均一; ;工业、医药方面应用的酶和蛋白工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂质制剂, ,达到一定纯度即可达到一定纯度即可, ,不要求均一。不要求均一。2 2、活性、活性: :要求大分子保持天然构象状态要求大分子保持天然构象状态, ,有高度的生物活有高度的生物活性。性。3 3、收率、收率: :希望收率越高越好希望收率越高越好, ,但在分离纯化过程中总有不但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多少损失。而且提纯步骤越多, ,损失越大。损失越大。三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序 蛋白

4、质分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段蛋白质分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段: 材料的选择和预处理材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） 分离纯化分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为分离纯化的前处理。其中前两个阶段为分离纯化的前处理。第二节第二节 蛋白质分离纯化的前处理蛋白质分离纯化的前处理一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理n选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本择含量

5、高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题虑上述问题,只要能达到实验目的即可。只要能达到实验目的即可。n实验材料选定后实验材料选定后,常常需要进行预处理常常需要进行预处理,如动物材料需要如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织;植物种子植物种子需要除壳需要除壳;微生物需要将菌体与发酵液分开。另外微生物需要将菌体与发酵液分开。另外,必须必须尽可能保持材料的新鲜尽可能保持材料的新鲜,尽快加工处理。若不立即进行尽快加工处理。若不立即进行实验或加工实验或

6、加工,应冷冻保存。应冷冻保存。二、细胞的破碎二、细胞的破碎n分离提取某一生物大分子分离提取某一生物大分子,首先要求生物大分首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来来,并保持原来的天然状态并保持原来的天然状态,不丢生物活性。因不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物泌物,则不必进行组织细胞的破碎。则不必进行组织细胞的破碎。n组织细胞的破碎方法很多组织细胞的破碎方法很多,不同的实验规模不同的实验规模,不

7、不同的实验材料和实验要求同的实验材料和实验要求,使用的破碎方法和使用的破碎方法和条件也不同条件也不同。v一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。或用超声波处理破碎。v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁等物质组成的细胞壁,一般常用与石英砂和适当的提一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。到目的。v细菌细胞的破碎比较困难细菌细胞的破碎比较困难,因为整个细菌细胞壁的骨因为整个细菌细

8、胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子子,非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。三、细胞器的分离三、细胞器的分离n细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网,植物细胞植物细胞还有叶绿体。还有叶绿体。n如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子,为了为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染防止其他细胞组分中的物

9、质对制备物的干扰或污染,还需还需先将细胞器分离出来先将细胞器分离出来,然后在某一细胞器中分离某一物质。然后在某一细胞器中分离某一物质。n细胞器的分离一般采用细胞器的分离一般采用差速离心法差速离心法,即将破碎后的细胞在即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心适当的介质中进行离心,常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同,经经过不同速度的离心后过不同速度的离心后,沉降于离心管的不同部位沉降于离心管的不同部位,经多次分经多次分步离心后步离心后,即可获得所需组分。即可获得所需组分。四、提取四、提取

10、n组织细胞破碎过程中组织细胞破碎过程中,大量的胞内酶及细大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来胞内含物被释放出来,必须立即将其置于必须立即将其置于一定条件下和溶剂中一定条件下和溶剂中,让制备物充分溶解让制备物充分溶解,并尽可能保持原来的天然状态并尽可能保持原来的天然状态,避免因长避免因长久放置造成制备物的分解破坏久放置造成制备物的分解破坏,这就是这就是提提取取。1 1、蛋白质的提取、蛋白质的提取n大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中溶液中,故蛋白质的提取一般以水溶液提取为故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液主。通常采用

11、类似生理条件下的缓冲液,如如20-20-5050m mol/Lm mol/L的磷酸盐缓冲液（的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5pH7.0-7.5）或或0.10.1mol/L Tris-HClmol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0）缓冲液作提缓冲液作提取液。取液。n对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质较多的蛋白质, ,不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸, ,常在提取液中加入适量的有机溶剂常在提取液中加入适量的有机溶剂, ,如乙醇、如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。丙酮、异丙醇、正丁醇等。第三节第三

12、节 蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化n从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯的从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯的,含有大量杂质含有大量杂质,必须进一步分离纯化必须进一步分离纯化,这一这一阶段可分为阶段可分为粗分级分离和细分级分离粗分级分离和细分级分离两步两步进行。进行。一、蛋白质的分离纯化一、蛋白质的分离纯化n蛋白质分离纯化的方法很多蛋白质分离纯化的方法很多,主要是根据蛋白分子之间特异主要是根据蛋白分子之间特异性的差异性的差异,如分子大小如分子大小,溶解度溶解度,电荷等建立起来的。电荷等建立起来的。 性质性质 方法方法v分子大小分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤透析、超滤、密度梯度离心、凝

13、胶过滤v 溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀v电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析v吸附性质吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）v对配体分子对配体分子 亲和层析亲和层析 的生物亲和力的生物亲和力 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法剂沉淀等方法,使目的蛋白与其它较大量的使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开杂蛋白分开,这些方法的特点是简便、处理这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质量大、既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白质又能浓缩蛋白质,但分

14、辨率低。但分辨率低。1 1、粗分级分离、粗分级分离（1 1）盐析）盐析l 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐向蛋白质溶液中加入大量的中性盐 （NHNH4 4) )2 2SOSO4,4,NaNa2 2SOSO4 4,使使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀蛋白质脱去水化层而聚集沉淀, ,这种现象称为盐析。这种现象称为盐析。l 盐析作用是由于当盐浓度较高时盐析作用是由于当盐浓度较高时, ,盐离子与水分子作用盐离子与水分子作用, ,使使水的活度降低水的活度降低, ,原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水水化水, ,从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用从而降低蛋白质极

15、性基团与水分子之间的作用, ,破破坏蛋白质分子表面的水化层坏蛋白质分子表面的水化层, ,使蛋白聚集沉淀。同时盐离子使蛋白聚集沉淀。同时盐离子可以中和蛋白质的表面电荷可以中和蛋白质的表面电荷, ,也促进蛋白的沉淀也促进蛋白的沉淀。l 不同的蛋白质分子不同的蛋白质分子, ,由于其分子表面的极由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同性基团的种类、数目以及排布的不同, ,其水化其水化层厚度不同层厚度不同, ,故盐析所需要的盐浓度也不一样故盐析所需要的盐浓度也不一样, ,因此调节蛋白质的中盐浓度因此调节蛋白质的中盐浓度, ,可以使不同的蛋可以使不同的蛋白质分别沉淀。如白质分别沉淀。如: :血清

16、血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度100%100%饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析（2 2）等电点沉淀）等电点沉淀n蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质, ,其溶解度与其净电荷数其溶解度与其净电荷数量有关量有关, ,随溶液随溶液pHpH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pHpH值等值等于蛋白质等电点时于蛋白质等电点时, ,蛋白质的溶解度最小。蛋白质的溶解度最小。n不同的蛋白质有不同的等电点不同的蛋白质有不同的等电点, ,因此通过调节因此通过调节溶液溶液pHpH到目的蛋白的等电点到目的蛋白的等电点, ,可使之沉淀而与可使之

17、沉淀而与其它蛋白质分开其它蛋白质分开, ,从而除去大量杂蛋白。从而除去大量杂蛋白。（3 3）有机溶剂法）有机溶剂法n与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。n有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个:v降低水的降低水的介电常数介电常数,使蛋白质分子表面可解离使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱基团的离子化程度减弱,水化程度降低水化程度降低,促进了促进了蛋白质分子的聚集沉淀。蛋白质分子的聚集沉淀。v是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水是极性有机溶剂与蛋白质

18、争夺水化水,而使蛋而使蛋白质分子沉淀。白质分子沉淀。n室温下室温下,这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀,而而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却,然后然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中,防防止有机溶剂局部浓度过高止有机溶剂局部浓度过高,则在很大程度上解则在很大程度上解决变性问题。决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同不同的蛋白质由于水化层厚度不同, ,发生沉淀发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同需要的有机溶剂浓度不同, ,因此可利用不同浓因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。度的有机溶剂

19、分离不同的蛋白质。2 2、细分级分离、细分级分离n一般蛋白质样品经粗制分级后一般蛋白质样品经粗制分级后,体积较小体积较小,杂质杂质大部分被除去。进一步提纯大部分被除去。进一步提纯,通常使用高分辨通常使用高分辨率的率的柱层析及电泳柱层析及电泳方法。方法。n常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。析、疏水吸附层析、亲和层析。n常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。聚焦电泳。n另外另外,结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一,制制备的结晶物常常作为蛋白质结

20、构分析之用。备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。 酶的活力测定酶的活力测定n在酶的制备过程中在酶的制备过程中, ,每一步骤都应测定留用以及每一步骤都应测定留用以及准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力, ,以了以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数, ,从而从而决定这一步的取舍。决定这一步的取舍。n总活力总活力= =活力单位活力单位/ /mlml酶液总体积（酶液总体积（mlml）n比活力比活力= =总活力单位数总活力单位数/ /总蛋白（氮）总蛋白（氮）mgmgn纯化倍数纯化倍数= =每次比活力每次比活力/ /第一次比活力

21、第一次比活力n回收率（产率）回收率（产率）= =（每次总活力（每次总活力/ /第一次总活力）第一次总活力）100%100%第四节第四节 蛋白质纯度鉴定蛋白质纯度鉴定n生物大分子经过分离提纯生物大分子经过分离提纯, ,最后还要鉴定制品的纯度。最后还要鉴定制品的纯度。n蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有:SDS-:SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法、免疫化学法、分析法、免疫化学法、N-N-末端氨基酸分析法等。末端氨基酸分析法等。v纯的蛋白质在一定条件下进行电泳纯的蛋白质在一定条

22、件下进行电泳, ,将以单一的速度移将以单一的速度移动动, ,它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中心场中, ,应以单一的沉降速度移动。应以单一的沉降速度移动。v选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度纯度, ,必须同时采用必须同时采用2-32-3种不同的方法才能确定。种不同的方法才能确定。第五节第五节 蛋白质的层析分离蛋白质的层析分离n应用广泛。特征应用广泛。特征: :有一个固定相和一个流动相。有一个固定相和一个流动相。由于待分离的各种物质在这两个相分配系数不由于待分离的各种物质在这

23、两个相分配系数不同同, ,当两个相作相对运动时当两个相作相对运动时, ,这些物质在两相间这些物质在两相间反复多次分配反复多次分配, ,结果使其相互分开。结果使其相互分开。n根据两相的状态根据两相的状态, ,层析法可分为层析法可分为: :气相层析和液气相层析和液相层析相层析; ;按层析原理可分为按层析原理可分为: :吸附层析、分配层吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操作形式分为等。按操作形式分为: :柱层析、薄层层析、纸柱层析、薄层层析、纸层析等。层析等。n 分配系数分配系数: k=C: k=Cs s/C/Cm m , ,物质在

24、固定相与流动相浓度之物质在固定相与流动相浓度之比。质量分配系数比。质量分配系数:D=k:D=kVs / Vm , Vs , Vm 为固定相为固定相和流动相的体积。和流动相的体积。一、层析的一般原理一、层析的一般原理 3216168816812412412228 如果柱顶加入如果柱顶加入32mg32mg样品样品, ,样品样品的质量分配系数的质量分配系数D D为为1 1, ,即样品在两即样品在两相中是等量分配。经过相中是等量分配。经过5 5层的平衡层的平衡分配后分配后, ,样品在柱的分配情况见图。样品在柱的分配情况见图。样品集中在中间。如果样品集中在中间。如果D1D1D1, ,样品集样品集中在中间

25、偏下。中在中间偏下。 离子交换层析离子交换层析( (IEX)IEX)是根据电荷来分离分子的。是根据电荷来分离分子的。 离子交换剂是通过化学反应将解离基团引入到惰性支持物离子交换剂是通过化学反应将解离基团引入到惰性支持物上形成的。分为上形成的。分为: 阳离子交换剂阳离子交换剂: 解离基团带负电解离基团带负电, 结合阳离子结合阳离子; 阴离子交换剂阴离子交换剂: 解离基团带正电解离基团带正电, 结合阴离。结合阴离。 蛋白质分子是两性物质。当蛋白质分子是两性物质。当pHpHpIpI,分子带负电分子带负电,可结合阴可结合阴离子交换剂离子交换剂;当当pHpIpHpI,分子带正电分子带正电,可结合阳离子交

26、换剂。如阳离可结合阳离子交换剂。如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡: 二、离子交换层析二、离子交换层析（一）基本原理（一）基本原理 带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。 由于由于pHpH可改变蛋白质的带电性质和带电量可改变蛋白质的带电性质和带电量,盐离子会影响蛋盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸附。所以用白质在交换剂上吸附。所以用一定浓度的盐溶液或一定一定浓度的盐溶液或一定pH 的缓冲液的缓冲液就可把蛋白质就可把蛋白质从离子交换剂上从离子交换剂上洗脱下来。洗脱下来。对多组分混合物对多组分混合物,每种分子所带

27、的电荷不同每种分子所带的电荷不同,因此因此,可用不可用不同的离子强度同的离子强度 或不同的或不同的pHpH溶液将蛋白质从交换剂上一溶液将蛋白质从交换剂上一一一洗脱下来。洗脱下来。 （二）离子交换剂的基本类型（二）离子交换剂的基本类型 根据可供交换的离子的性质根据可供交换的离子的性质,离子交换剂可被分为阳离子交换剂可被分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱,又可又可分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。 强 酸 和 强 碱 型 交 换 剂 能 在 较 广 泛 的强 酸 和 强 碱 型 交

28、 换 剂 能 在 较 广 泛 的 pH范 围 内范 围 内（pH212）完全解离。弱酸型交换剂在低于完全解离。弱酸型交换剂在低于pH4、弱碱型交换剂在高于弱碱型交换剂在高于pH9就难于解离就难于解离,因而失去交换能因而失去交换能力。因为一般蛋白质在力。因为一般蛋白质在pH68之间稳定之间稳定,所以常用弱酸所以常用弱酸或弱碱型交换剂。或弱碱型交换剂。离子交换基团的结构和性质离子交换基团的结构和性质类型类型名称名称结构式结构式性质性质DEAE二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱碱性弱碱性QAE季胺乙基季胺乙基(quatern

29、ary aminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3强碱性强碱性Q季胺季胺(quaternary amine)-CH2-N+-(CH3)3 强碱性强碱性CM羧甲基羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO -弱酸性弱酸性SE磺乙基磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-强酸性强酸性SP磺丙基磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-强酸性强酸性P磷酸基磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性中酸性S磺酸基磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-强酸性强酸性 可用来作为交换剂支持物的物质种类较多。早期用于

30、分离可用来作为交换剂支持物的物质种类较多。早期用于分离氨基酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂的支持物是氨基酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂的支持物是聚苯聚苯乙烯类乙烯类。 分离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类分离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类:纤维素、葡纤维素、葡聚糖凝胶聚糖凝胶(sephadex)、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(sepharose)和合成凝胶和合成凝胶(Trisacryl和和Fractogel)。1、离子交换纤维素、离子交换纤维素 离子交换纤维素是以纤维素做支持介质的。具有松散的亲离子交换纤维素是以纤维素做支持介质的。具有松散的亲水性网络水性网络,较大的表面积较大

31、的表面积,吸附容量大吸附容量大,通透性好。根据离子交换通透性好。根据离子交换纤维素所含离子交换基团的性质可分为强酸、强碱型和弱酸、纤维素所含离子交换基团的性质可分为强酸、强碱型和弱酸、弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。常用的离子交换纤维素常用的离子交换纤维素离子类型 解 离 基 团特 点DEAE-OCH2CH2N+(C2H5) 在 pH8.6 应用 阴离子阴离子解离基团解离基团交换交换摩尔摩尔(m mol/g) 特点特点DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.1 在在pH4应应用用POPO3H20.77.4酸性较强酸性较强SEOCH2

32、CH2SO3H0.20.3强酸性强酸性 在在Sephadex上接上某种离子交换基团。这上接上某种离子交换基团。这种凝胶既有离子交换剂的性质种凝胶既有离子交换剂的性质,又有分子筛效应。又有分子筛效应。因此因此,其分离能力比单纯的层析凝胶或离子交换其分离能力比单纯的层析凝胶或离子交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子交换剂大的纤维素离子交换剂大,如如DEAESephadex的的交换量大约是交换量大约是DEAE纤维素的纤维素的3.55.0倍。倍。2、离子交换葡聚糖凝胶（、离子交换葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶离子交换剂的性质葡聚糖凝

33、胶离子交换剂的性质 类别类别离子交换基团离子交换基团床体床体积积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量(m mol/g) 强阳离子交强阳离子交换剂换剂SESephadex C25 C50-CH2CH2SO3H5932383104- 21053104-21052.02-52.02-5 SPSephadex C25 C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.3 弱阳离子交弱阳离子交换剂换剂CMSephadex C25 C50-O-CH2COOH61032403104-21053104-2105 4.50.5 强阴离子交换剂强阴离子交换剂QAESephadex A25

34、A505830403104-21053104-2105 3.04.0 弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂DEAESephadex A25 A50-C2H4N+(C2H5)2H592583 3104-21053104-21053.54.5 类别类别离子交换基团离子交换基团床体积床体积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量(m mol/g) -O-C2H4N+(C2H5)2 将各种离子基团引入到交联琼脂糖将各种离子基团引入到交联琼脂糖(Speharose CL)和大孔合成凝胶和大孔合成凝胶(Trisacryl或或Fractogel)上上,则则形成一系列离子交换剂。这类交换剂即坚

35、硬、吸附形成一系列离子交换剂。这类交换剂即坚硬、吸附容量大容量大,形状球形形状球形,能维持较好的流速及分辨率。能维持较好的流速及分辨率。3、交联凝胶离子交换剂、交联凝胶离子交换剂（三）层析条件的选择（三）层析条件的选择1、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择 选择离子交换剂之前要了解样品的性质选择离子交换剂之前要了解样品的性质:热稳热稳定性、带电情况、定性、带电情况、pH和盐浓度对其活性和溶解度的和盐浓度对其活性和溶解度的影响。一般情况下影响。一般情况下,带负电的物质用阴离子交换剂带负电的物质用阴离子交换剂,反反之之,则用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的是则用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的

36、是DEAE和和CM 交换剂。交换剂。 2、交换颗粒大小的选择、交换颗粒大小的选择 粒子大小主要影响分辨率和流速。粗粒子大小主要影响分辨率和流速。粗粒子粒子:交换容量小、间隙大、分辨率底、流速交换容量小、间隙大、分辨率底、流速较快。细粒子较快。细粒子:分辨力高、交换容量大但是分辨力高、交换容量大但是流速慢。流速慢。3、层析缓冲液的选择、层析缓冲液的选择 选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子相互作用取决于离子相互作用取决于pH,而维持介质的而维持介质的pH,通常是由缓通常是由缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、冲液来实现的。所用缓冲液的种类、pH大

37、小大小,决定决定 待分待分离组分的稳定性和溶解度。离组分的稳定性和溶解度。 为避免缓冲液的离子参与离子交换过程为避免缓冲液的离子参与离子交换过程,采用缓冲采用缓冲液所带的电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳液所带的电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳离子交换剂时离子交换剂时,要用阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸等）要用阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸等）;使用阴离子交换剂时要用阳离子型缓冲液（使用阴离子交换剂时要用阳离子型缓冲液（Tris、胺盐、胺盐、吡啶等）。吡啶等）。 要得到好的分离效果要得到好的分离效果,层析时要注意层析柱的高度和层析时要注意层析柱的高度和体积体积;上样量的大小上样量的大小;洗脱

38、液体积洗脱液体积;洗脱速度洗脱速度;分级物的收分级物的收集量。集量。1、柱床体积、柱床体积:至少要比结合所有样品所需要的要大至少要比结合所有样品所需要的要大25倍。离子交换层析所用的柱不用太长倍。离子交换层析所用的柱不用太长,以便缩短操作时以便缩短操作时间。间。2、样品、样品pH 和离子强度和离子强度:与起始缓冲液具有相同的与起始缓冲液具有相同的pH和离和离子强度。子强度。3、洗脱液体积和洗脱梯度的形状、洗脱液体积和洗脱梯度的形状:对柱的分辨率影响很大。对柱的分辨率影响很大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成（简单洗脱）也可洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成（简单洗脱）也可用改变用改变pH或盐浓度或盐

39、浓度,或二者均改变的洗脱液来完成。或二者均改变的洗脱液来完成。pH和盐浓度的改变又分为连续改变（梯度洗脱）和不和盐浓度的改变又分为连续改变（梯度洗脱）和不连续改变（阶段洗脱）连续改变（阶段洗脱）。（四）柱层析技术（四）柱层析技术 交换剂的处理就是将交换剂转变为适合分离目的的离交换剂的处理就是将交换剂转变为适合分离目的的离子类型。一般包括除杂质、溶胀子类型。一般包括除杂质、溶胀,除细粒和改型。改型就除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡是用适当的离子平衡,使交换剂带上希望的离子。阳离子使交换剂带上希望的离子。阳离子和阴离子交换剂最后分别为和阴离子交换剂最后分别为Na和和Cl型是最稳定形式。型是最

40、稳定形式。4、洗脱速度、洗脱速度:太快或太慢都会降低柱的分辨率。太快或太慢都会降低柱的分辨率。5、分级物收集量、分级物收集量:关系到能否充分代表层析柱的分辨关系到能否充分代表层析柱的分辨率。一般总洗脱体积在率。一般总洗脱体积在5002000ml时时,每管收集每管收集510ml（五）离子交换剂的处理和再生（五）离子交换剂的处理和再生 离子交换剂价格较贵离子交换剂价格较贵,用后再经过再生处理用后再经过再生处理,可反复可反复多次使用。处理时避免用强酸或强碱长时间浸泡多次使用。处理时避免用强酸或强碱长时间浸泡,以防以防载体的糖链结构遭水解破坏。载体的糖链结构遭水解破坏。 剂型剂型处理用的酸或处理用的酸

41、或碱浓度碱浓度浸泡时间浸泡时间纤维素纤维素 SephadexSepharose合成凝胶合成凝胶0.5M HCl或或NaOH(含含0.5M NaCl)0.1M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)1M NaAc (pH3.0)或或0.1M NaOH(含含1M NaCl)0.51.0M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)34h0.5h可在柱中再可在柱中再生生长时间浸泡长时间浸泡无影响无影响各类离子交换剂的再生条件各类离子交换剂的再生条件 血清蛋白常用离子交换层析分离。血清蛋白常用离子交换层析分离。IgG可用可用QAESephadex A50或或DEAESephadex A50分离。现在临床上有重要用途的许多血清蛋白分离。现在临床上有重要用途的许多血清蛋白,如白蛋白如白蛋白,factor IX复合物和专一性免疫球蛋白已复合物和专一性免疫球蛋白已用离子交换层析大规模生产。用离子交换层析大规模生产。（六）离子交换层系的应用实例（六）离子交换层系的应用实例 凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析凝胶层析又