T载体与目的基因连接

1、 一.重组质粒的构建T质粒载体 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接 酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连 接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连 接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化 DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA

2、连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺昔化； 最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3端加上一个突出的碱基AopUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3端带有一 个突出的To这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对， 在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的 重组载体。 连接反应的温度在37C时有利于连接酶的活性。但是在这个温

3、度下粘末端的氢键 结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16C,连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二.感受态制备原理 细菌在0 CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。 三.B-半乳糖甘酶显色反应选择法 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码3半乳糖核甘酶。 3一半乳糖核甘酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解.用X-Gal为底物 进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有3半乳糖核甘酶的调控序列和3半乳糖核甘酶N端146个氨基酸（“肽段）

4、的编码序列，在这个编码序列里还 插入一个多克隆位点（MCS，它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有 3一半乳糖核甘酶C端部分序列（3肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这 些质粒与大肠杆菌各自编码的3半乳糖核甘酶片段都没有酶的活性。 只有当携带“ 肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质 粒能够合成3一半乳糖核甘酶N端（“肽段），这样就与宿主细胞合成的3一半乳糖 核音酶C端部分序列（3肽段）互补，形成完整的3一半乳糖核甘酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能 表达，从而不能合成3一半乳糖核甘

5、酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过“ 互补合成3一半乳糖核甘酶，分解培养基里的色素底物X-gal,最终形成蓝色的化合 物，出现蓝色菌斑。实验准备：清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶， 接种环，涂布棒。准备100ml超纯水。溶液:LB300ml（液体50ml+50ml,固体100ml）,LCaCl210ml,100mg/mlAmp1ml,20mg/mlX-gal1ml,200mg/mlIPTG1ml。大肠杆菌菌液 1ml。 感受态细胞 连接产物 4管 4x5=20ul 做4份 目的基因 T载体 T4连接酶 10 x冲液 4x4uL 4x1uL 4x1u

6、L 灭菌：5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种 环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基，管，大小枪头，过滤用具2副，LCaCl2 实际配置20mg/mlX-galX-gal为5-澳-4-氯-3-口引喋-3-D半乳糖甘。用二基甲酰 胺（DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml（取，用DMF定容为1ml）的贮存液。保存于 一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏， 并应贮存于-20C。X-gal溶液无须过滤除菌。（DMF二甲基甲酰胺;Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide;DMF;CA

7、S:68-12-2理化性质：无色、淡的胺味的液体。 分子式C3-H7-N-O。分子量。相对密度（25C）。熔点-61Co沸点C。）溶于DMSQ 溶解度可达20mg/ml。也溶于DMF溶于DMSQ溶解度可达20mg/ml。也溶于DMF 200mg/mlIPTG在蒸储水中溶解IPTG后，用蒸储水定容至1ml,用科m滤器过 滤除菌，贮存于-20C。 LB培养基： 配制每升培养基 5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至.用去离子水定容至1L. 在15Psi高压下蒸汽灭菌20min.（100mlLB培养基加入琼脂粉为固体培养基） LCaCl2:取氯化钙固体定容至10ml

8、Amp100mg/ml）:溶解氨苇青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml, 用mm滤膜过滤除菌. 实验过程 （一） .目的基因片段与载体连接 器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，管架，台式离心机，干式恒温气浴。 试齐I T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌 操作步骤 PCR产物与T载体直接连接： （1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416 C （2） 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4ml目的基因； 1mlT载体；T4DNA连接酶（TAKARA,350U/ul）;1ml连接酶缓冲液10 xbuffer;mlddWater，总量10ml体系

9、。 （3） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14。C干式恒温仪（或14。C水中）中保温过夜（12-16h）。 （4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4。C冰箱备用。 （二） .大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化 仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头,微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工 作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已 铺好固体LB-Amp）,酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器 试剂：E.coli菌种，LB培养基，mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater, LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加

10、抗菌素），无菌ddwater,IPTG, X-gal。 步骤（1）在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100mlLB液态培养基（不含 ，应该在950ml去离子水中加入：胰化蛋白月东10g酵母提取物 微量离心管，双面离心 ddWater。 50ml微量离心管, 抗菌素），37c摇床培养过夜。 (2) 取上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37c下250r/min 摇床培养23h,测定0口590为左右(,细胞数108/mL,此为关键参数！)。(注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌) (3) 将1ml菌液加入到4支预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min,

11、 然后于4C,5000rpm离心5min。 (4) 将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30mino (5) 4C,5000rpm离心5min,弃上清液后，用100dL冰冷的mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h,可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。 (6) 事先将恒温水浴的温度调到42o (7)从-70C超低温冰柜中取出一管(100LL)感受态菌，立即用手指加温融 化后插入冰上，冰浴510min。 (8)加入5dL连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放 置冰上20min。 (

12、9) 轻轻摇匀后插入42c水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。 (10) 在超净工作台中向上述各管中分别加入300科LLB培养基(不含抗菌素) 轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37c震荡1h。 (11)在超净工作台中取上述转化混合液200dL,分别滴到含合适抗菌素(Amp 100ug/L)的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40dL20mg/mlX-gal,7L 200mg/mlIPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意： 一个不含抗生素作为对照组， 玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变

13、化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。)。 (12) 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37c恒温培养箱中30min直到表 面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37C恒温培养箱过夜。 (13) 在被细菌污染的桌面上喷洒70叱醇，擦干桌面。 (14) 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。 (三).转化克隆的筛选和鉴定 器材旋涡混合器，小镣子，微量移液取样器，移液器吸头，微量离心管，双 面离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)，制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。 试齐ILB培养基(加抗菌素)，PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶

14、切需要 的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油(65%甘油，LMgSO4,LTrisCl)。 操作步骤方法一：快速PCR筛选法 (1) 在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔 在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。 (2)在PCR微量离心管中配制25科l反应体系。 ddwater16科l 10 xPCRbuffer(不含MgCl2)科l 25mMMgCl2科l LdNTP2pl(每种dNTP终浓度) 10mol/LPrimer11科l(25pmoles) 10mol/Lprimer21科l(-25pmoles) 模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入P

15、CR混合液中洗一洗 Taq酶(1l() 总体积25科l (2)根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序(本实验室已经设置为WZ: 94c5min94C1min60C1min72C1min50sgoto29times72c10min (2) PCR结束后， 取10l产物进行琼脂糖凝胶电泳(与原始插入片断同时比对)。 观察胶上是否有预计的主要产物带。 (3)按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒 (4)提取到的质粒与原先的空载体(或已知分子量的质粒)再对比电泳，以进一步确认。 方法二：提质粒再PCR或酶切鉴定 (1)在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mLLB(含50mg/mL氨茉青霉 素)，用记号笔写好编号。 (2)在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镣子头用酒精灯烤过，镣取一支无菌牙 签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有 3mLLB(含50mg/mL氨茉青霉素)的摇