MicroRNA研究概况以及MicroRNA芯片技术简述MicroRNA的研究

1、MicroRNA 研究概况以及 MicroRNA 芯片技术简述一、 MicroRNA 的研究概况1. MicroRNAMicroRNAmiRNA , miR是由约21-25个核苷酸组成的分子， microRNA 通过抑制 mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。最初 miRNA 的功能在植物学、癌症、病毒性感染和发育生物学中得到了验证。但最近的研 究发现，患有心脏疾病的小鼠对照正常状态 miRNAs 失调，并且在肥大的心脏 中也检测到了数种 miRNA 的上调或者下调， 同时体外实验也证实了它们对心肌 细胞形态的影响。2. MicroRNA 的研究进展miRNA现象的最早报道是在

2、佃80年的Genetics和Cell上。佃93年在线虫中发现的lin-4 是第一个被确定的 miRNA 31，它的基因产物是 21 个核苷酸的 RNA 分子并且局部序列互 补于lin-14 mRNA的3' UTR区域。这些互补序列使lin-4间断地与lin-14 mRNA结 合。奇怪的是，lin-4没有明显地改变lin-14 mRNA的量，但是Lin-14蛋白表达 却明显降低。2000年又在线虫中发现了与 lin-4相似的miRNA let-7，它们参与线虫 发育的时空调节。miRNA基因首先被RNA聚合酶H转录为较长的初始转录本，该转录本含有数 千个核苷酸，称其为 pri-miRNA

3、。在pri-miRNA内，miRNA位于由大约70个核苷酸 构成的环柄结构内。在动物体内，该环柄结构在细胞核内被RNA酶川Drosha和其辅助蛋白 Pasha/DGCR8 识别和切割，形成 pre-miRNA 。之后， pre-miRNA 迅速被核质 /细胞质转运蛋白Exportin5转运至细胞质，被位于细胞质内的 RNA酶川Dicer 进一步切割。产生一个类似于 siRNA 的 miRNA ：miRNA* 复合体，随后，该双链体 解旋为成熟的 miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在一种 ATP-依赖的沉默复合体 RISC 中，形成非对称的 RISC 复合物。而 miRNA* 那么可能类

4、似于 siRNA 被 Argonaute 蛋白处理 掉。成熟miRNA通过与特定靶基因 mRNA的3' UTR完全或不完全的碱基互补方式 引导 RISC 与目的 mRNA 结合，从而降解靶 mRNA 或抑制靶 mRNA 的翻译见图 1，其 中以抑制翻译为主。 另外最近发现 miRNA 与靶 mRNA 结合后， 可使靶 mRNA 被外切酶降 解。miRhjA ww-Cytaplswi NucleusPtBHTiiRN 串EjpwlinJ.(OQnnc(rnRW-fnHJMA-)Tianhboiral repressionnhRNA dsiMsgatOttht图1 miRNA的形成和功能模

5、式图miRNA是一类进化上保守、在生命中起着重要调控作用的分子。多种miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中，这个环境控制着成千上万的编码基因的 mRNA水平，使得各种蛋白的表达处在一个 适合的水平。miRNA的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在 RNA水平对靶mRNA分子进行更迅速和有效的调节， miRNA的发现也是对中 心法那么中RNA次要的中介角色的重要补充。 miRNA在基因组中的数量预计 在人类基因中含量1%，参与至少10%基因的表达调控和表达水平一些 miRNAs在每个细胞中的拷贝数1000，说明miRNA是一种含量丰富的 RNA 种类。而且

6、每个miRNA具有调节数百个mRNA的潜能；因此在各类小分子RNA 中，miRNA具有最广泛的基因调节功能，它能对基因活动的各个层面进行调节。 miRNA的靶基因一般为动植物中发育基因，说明 miRNA在控制生物发育方面 有不容无视的作用。miRNA可参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚 胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢等方面。随着近年来研究的不断深入，人们开始认识到小RNA分子在真核基因表达 调控中有着广泛的作用。目前研究发现miRNA发挥功能的领域有：生物个体发育；组织分化；病毒感染；参与癌基因作用。随着对miRNA研究的不断增加，已经有大量的 miRNA为科研工作者们

7、发现。 近年来,更是随着生物信息学的不断进步，通过预测发现了更多的miRNA，但是这些预测的结果还 必须要通过实验的验证才能为事实所接受。目前 miRNA 的研究领域主要包括 miRNA 表达谱和 miRNA 功能分析。由于 miRNA 在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖、凋亡以及与肿瘤发生相关等领域发 挥作用， miRNA 的鉴定和定性研究成为迅速开展的一大研究领域。最典型的鉴定 miRNAs 的方法是检测 miRNA 的表达谱， 如果发现某一种 miRNA 在某种特定组织或细胞中特异性 表达的话， 此 miRNA 将被假定在此特定组织或细胞中发挥某种调控作用。同样， 如果某一种 mi

8、RNA 在生物特殊发育阶段表达的话，那么它有可能是调控发育进程一个主要分子。 miRNA 的表达谱可以通过克隆特定组织、细胞或者某个生物体特定发育阶段的 miRNA 并 测序完成， 或者通过芯片检测得以完成。 克隆和测序 miRNA 是目前最常用的一种方法， 虽 然相当费时费力，但却可以发现新的miRNA ；而芯片检测虽然是一种高通量的检测方法，但只能检测的 miRNAs 表达水平。随着成百上千的 miRNA 被鉴定出来，通过抑制细胞中 mRNA 的表达水平来研究 miRNA 的功能迅速开展为一个重要的研究领域。在此期间， miRNA 在生理状态下的靶标 须待鉴定， 因此在探索 miRNA 功

9、能的过程中运用人工合成的 miRNA 抑制剂成为一种重要 的研究工具。 miRNA 的活性可以通过对与内源性 miRNA 互补的磷酰二胺吗啉代反义寡核 苷酸( morpholino phosphorodiamidate anti-sense oligonucleotides )的化学修饰阻断。另 外，反义阻断的核苷酸( locked-nucleic acid, LNA )具有更高的结合亲和力，通常被用来抑 制人体细胞的 miRNA 。 LNA 修饰的探针也用来检测 miRNAs 的定位和表达方式。二、 MicroRNA 芯片技术简述1. 样品 RNA 抽提a. 实验对象为组织样品，取适量(50

10、-100mg)新鲜组织样品或正确保存的 组织样品，冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂Trizol,匀浆后抽提RNA。b. 实验对象为细胞样品，每份样品取 1X1071X108细胞，加1ml的RNA 抽提试剂Trizol，样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿Trizol使用量为1ml，裂解 后抽提 RNA。2. RNA 质量检测a.测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓 度并评估纯度。b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测 RNA 纯度及完整性。c.提供RNA QC报告。注意：用于芯片检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有 RNase污染降解的样品不能用于标记和芯片检测，没有基因组污染。3. 制备荧光标记探针荧光基团标记miRN