OGT蛋白O-GlcNAc修饰位点定位及其对sOGT功能影响

1、.摘要摘要OGlcNAc是广泛存在于蛋白质丝苏氨酸残基上的一种动态、可逆的蛋白翻 译后修饰。研究表明，OGlcNAc修饰与神经退行性疾病、糖尿病、癌症等许多 疾病密切相关。OGlcNAc修饰过程由-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和乙酰 氨基葡萄糖苷酶(OGA)共同调节完成。其中，OGT负责0GlcNAc的添加，而OGA 负责OGlcNAc的移除。体内存在三种不同类型的OGT：分子量为1 1 6KD的ncOGT (nuclear cytoplasmic OGT)、1 03KD的mOGT(mitochondrial OGT)齐I78KD的 sOGT(short OGT)。事实上，OGT不仅可以糖基

2、化其底物蛋白或多肽，还能够进行自身OGlcNAc 糖基化修饰。但对于这方面的研究报道还少之甚少，该修饰对OGT的具体调节 机制及其在体内起到何种作用还并不清楚。体外研究表明，三种类型的OGT中sOGT的自身OGlcNAc修饰现象最为显 著，因此我们选择sOGT作为本文的研究对象。本文利用大肠杆菌表达系统及镍 亲和层析方法得到了纯度较高、活性较好的sOGT蛋白；借助LCMS、定点突变 PCR、Western Blot等技术实现了sOGT蛋白上6个OGlcNAc修饰位点(T12，S1 8 T38，$52，T449，T662)的定位；分别以十七肽CKII、Nup62蛋白为底物初步探索 了OGlcNA

3、c修饰对sOGT功能的影响。结果发现，OGlcNAc修饰对于sOGT的多 肽糖基转移酶活性并无显著影响；但当以Nup62蛋白为底物时，sOGT wT可以对 Nup62进行糖基化修饰，而缺失OGlcNAc修饰的sOGT突变体(T12A&S18A& T38A&S52A&T449A&T662A)贝lJ不能将Nup62蛋白糖基化，这说明OGlcNAc修 饰对sOGT的功能有一定影响。此项研究对于理解OGT对细胞途径的调节机制起 到很大帮助作用，并为今后的相关研究工作提供了科学依据。 关键词：乙酰氨基葡萄糖转移酶sOGT，自身OGlcNAc修饰，OGlcNAc修饰

4、 位点定位，功能影响；：AbstractAbstractThe addition of Olinked 13-N-acetylglucosamine(O-GlcNAc)to SerThr residues of nuclear and cytosolic proteins is dynamic，inducible，and post-translational modification which is related to mechanisms of many diseases such as diabetes，cancer,neurOdegeneration diseasesO·G

5、lcNAcylation is regulated by N-acetylglucosamine transferase(OGT)and N-acetylglucosamindase(OGA)which are in charge of the addition and removal of OGlcNAc respectivelyThree types of OGT exist in vivo：ncOGT(nuclear cytoplasmic OGT)，mOGT(mitochondrial OGT) and sOGT(short OGT)In fact，OGT not only glyco

6、sylates its protein and poly-peptide substrates，but aslo Can be self-O-GlcNAcylated to which little attention has been paidIt is still unclear how OGlcNAcylation regulates OGT and its specific role in regulating cellular processesStudy in vitro reveals that among the three types of OGT，self-O-GlcNAc

7、ylation of sOGT is most significant，for which sOGT is chosen as our research obj ectIn this study，sOGT with high purity and activity is obtained using Ecoli and Ni2+affinitycolumnThen 6 O-GlcNAcylation sites on sOGT(T12，S18，T38，$52，T449，T662)are mapped by LC-MS and Western BlotThen we investigated f

8、unctional effect of OGlcNAcylation on sOGT respectively using polypeptide(CK II)and protein (Nup62)as substratesResults shows that 0-GlcNAcylation has no significant effect on the function ofsOGT towards CK IIbut sOGT FM(T12A&S18A&T38A&S52A&T449A&T662A)fails to transfer GlcNAc to

9、 Nup62 which means OGlcNAcylation has certain effects on sOGTS functionThis study helps understanding OGTS regulatory mechanism of cellular processes and provides new basis for future workrelatedKey Words：N-acetylglucosamine transferase(sOGT)，self-OGlcNAcylated，0-GlcN-Acylation-site-mapping，fuctiona

10、l effect；II符号说明符号说明英文缩写英文全称中文名称OGTOlinked3-N-acetylglucosamine transferaseD连-乙酰葡糖胺转移酶UDP-GlcNAcUridine 5'-diphospho-N-acetylglucosamine尿苷二磷酸水乙酰氨基葡萄糖PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应SDSPAGESodium Dodecyl SulphatePolyacrylamide Gel十二烷基磺酸钠一聚丙烯Electrophoresis酰胺凝胶电泳CKIICasein kinase II酪蛋白激酶IIHPLCHi

11、gh Performance Liquid Chromatograph高效液相色谱MSMass Spectrum质谱WBWestem Blot免疫印记sOGTWTsOGT Wild TypesOGT野生型sOGTFMsOGT FuU MutantsOGT全突变体DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇BSABovine Serum Albumin牛血清白蛋白第一章前言第一章前言糖、蛋白质、核酸是生物体内所存在的三类最基本的大分子物质。 旨在通过研究生物大分子的结构、功能和生物合成等方面内容来阐明各种生命现象本质的分子生物学对核酸和蛋白质的

12、研究已经取得十分显著的成就， 特别是以人类基因组测序完成为代表的基因组计划以及在此基础上开展起来的 蛋白质组学研究。然而，这并不能阐明所有的生命现象，尤其是一些多细胞生 物的高层次生命现象，例如受精机制等。于是许多研究者从以上研究转向了糖 组学研究，希望从糖链(包括糖复合物)的结构和功能中找到答案。第一节蛋白质的糖基化修饰糖类作为结构成分如纤维素、半纤维素及果胶物质和作为主要能源储存物 质如淀粉、糖原等早在40年以前就为人们所熟知。随着分离分析技术和分子生 物学的发展，糖类的其他诸多生物学功能得以不断地被揭示和认识，例如细胞 粘着、接触抑制代谢调控(激素与受体)等重要的生命活动中都有糖类的参与

13、。 糖类不仅以寡糖、多糖等游离形式存在，如葡萄糖、淀粉、纤维素等。更主要 的是以共价键形式与非糖物质如蛋白质、脂类相连，形成糖复合物参与许多重 要的生命过程。在酶的作用下，糖链以共价键形式与蛋白质多肽链中的氨基酸 残基相连接形成糖复合物的过程称为蛋白质的糖基化修饰。蛋白质的糖基化修饰是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰，对蛋白质的结构和功能有着重要的影响，进而影响许多重要的生命过程。111糖基化类型根据糖链与蛋白质多肽链中氨基酸残基连接的糖肽键类型，蛋白质糖基化 可以分为以下四种：1111 N-糖基化聚糖中p一构型_乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)与多肽链中天冬酰胺(Asn)的 B酰胺N原子共价连接

14、而修饰蛋白质。根据其末端糖链的精细结构，-糖基化又1第一章前言可以分为复杂型、高甘露糖型以及杂合型。这种糖基化类型的修饰位点具有一 个相对保守的特异序列，臣NAsnXThrSer，其中X为除Pro：夕b的任一氨基酸。1112 0糖基化 聚糖末端单糖的异头碳与羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸等)的羟基O原子共价结合而修饰蛋白质。至今还没有发现此类糖基化修饰位点的特异 序列，但其多发生在临近脯氨酸(Pro)的羟基氨基酸残基上。D糖基化有些只 连接一个单糖，但多数以逐步加接单糖的方式形成低聚糖。1113 C-糖基化【1j这是一种在生命体中比较罕见的糖基化修饰方式。C-糖基化通过一分子甘 露糖基以

15、CC键与色氨酸吲哚环2号位C相连而修饰蛋白质。这类糖基化方式多发 生在wxXw、wxxC或wxXF序列的首个色氨酸残基上。1114糖基磷脂酰肌醇锚(GPIanchor)糖基化 GPI锚一般是由乙醇胺、糖核心和肌醇三部分连接而成，其中肌醇通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，而乙醇胺则通过酰胺键与蛋白质的C端相连，最终将蛋白质锚定在细胞膜上。生物体内，带有这种糖基化修饰的蛋白有很多 种，其中包括与免疫功能相关的细胞膜蛋白或受体和一些水解酶类等。112糖基化的生物学功能 生物体内的蛋白质存在磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化等多种修饰方式，其中糖基化是最重要的翻译后修饰之一。在生物体中50以上的蛋白质

16、存在糖基化现象2】，包括核孔蛋白、转录因子、染色质蛋白、蛋白翻译调控因子、RNA 聚合酶等等，涉及到信号转导、细胞免疫、基因转录、蛋白酶解等多种生物过 程。1121参与糖蛋白新生肽链折叠和缔合已有不少事实证明，蛋白质的-糖基化修饰参与新生肽链的折叠，并帮助 维持蛋白质的正确构象。例如，衣霉素抑制流感病毒繁殖的作用机制是衣霉素 抑制宿主细胞-糖链前体合成的第一步，即uDPGlcNAc与多萜醇的加成反应，2第一章前言使得流感病毒红细胞表面凝集素的多肽部分虽然能够合成，但由于不含有-糖 链而不能够正确折叠，继而无法形成三聚体，因此不能被分泌到胞外。1122参与糖蛋白的分泌和稳定性 糖基化与糖蛋白分泌

17、至胞外也有一定关系。在基因工程中，真核细胞所表达的糖蛋白由于含有糖基化修饰而不发生聚集，故能够分泌到胞外，然而缺乏糖基化修饰方式的原核细胞所表达的产物则常因无法分泌到胞外而在细胞内聚 集形成包涵体。糖基化对蛋白质的构象和稳定性也有一定影响。例如，在正常情况下，低 密度脂蛋白受体(LDL受体)含有大约30条0糖链修饰。在缺失D糖链结构的 培养细胞中，LDL受体虽能形成并正常转运至质膜，但极易被细胞表面的蛋白酶 所降解并释放至胞外。1123参与分子识别和细胞识别 许多分子识别和细胞识别过程也依赖于蛋白质的糖基化修饰。血清中有很多唾液酸糖蛋白(即其糖基化修饰部分是以唾液酸为末端的糖链)，如载体蛋白等

18、。 当糖蛋白的末端唾液酸残基被唾液酸酶切除并因而将半乳糖残基暴露出来后，该 糖蛋白很快被肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体识别并结合形成糖蛋白受体复 合物。该复合物通过胞吞作用被肝细胞内化，最终糖蛋白在溶酶体内被降解。1124参与蛋白质的翻译调控 真核生物蛋白翻译起始过程中，若真核起始因子elF2发生磷酸化修饰则无法起始翻译过程。Gupta等人B4鉴定了一个能使eIF2免受磷酸化的e-IF 2关联蛋白p67且该蛋白带有OGlcNAc糖基化修饰。通过与凝集素WGA共培养而失去 OGlcNAc修饰的p67蛋白保护eIF2免受磷酸化的能力明显降低，从而导致eIF2的磷酸化，抑制了蛋白质的起始合成。第二节

19、OGIcNAc糖基化修饰0一GlcNAc糖基化是由Hart等人于1984年发现的一种以0糖苷键将单个-乙 酰氨基葡萄糖(DGlcNAc)连接到蛋白质丝氨酸苏氨酸羟基上的蛋白质翻译后修3第一章前言饰。该过程EhN-乙酰氨基葡萄糖转移酶OGT和N-E_,酰氨基葡萄糖苷酶OGA共同 调节完成(图11)。”暑：图11 0一GIcNAc修饰发生示意图与其他形式的蛋白糖基化修饰不同，0GlcNAc修饰同时广泛存在于胞核和 胞质中。目前已知可以被其修饰的蛋白己有上千种之多，随着该修饰检测技术 的改善，科学家们将会发现更多的O-GlcNAc修饰蛋白。这些蛋白几乎参与所有 的细胞途径，OGlcNAc修饰赋予它们

20、特定的生物学效应，进而调控生物体内各 种细胞过程。121 O-GlcNAc糖基化与磷酸化O-GlcNAc糖基化与磷酸化是两种非常重要的蛋白质翻译后修饰，这两种修 饰之间存在的广泛相互作用已经为不少研究所证实。例如，研究者们通过糖原 合成酶激酶GSK3p抑制剂处理cos7细胞使得细胞内蛋白磷酸化水平下降，发现 细胞内多种蛋80GlcNAc修饰水平均有明显的升高或降低【5J；相反，改变细胞 蛋白的OGlcNAc修饰水平也同样引起多种蛋白的磷酸化水平的明显变化【6J；Zihao Wang掣7】通过在细胞内过量表达DGlcNAc转移酶OGT弓I起了胞质分裂的 紊乱以及多倍体的生成，该过程同样伴随有多种

21、细胞分裂相关蛋白磷酸化水平 的改变。OGlcNAc糖基化与磷酸化间相互作用为多种机制所调节：1211相邻或相同的SerThr彦饰位点 根据文献报道，迄今为止已有约1500个OGlcNAc修饰位点被鉴定：1)有些O-GlcNAc修饰位点恰好也是该蛋白质的SerThr磷酸化修饰位点，则这两种修饰 为争夺共同的修饰位点而形成竞争关系。如：致癌基因蛋白cMyc的Thr58瞵J，雌 激素受体p的serl6【9】，内皮一氧化氮合酶eNOS1伽和l矾A聚合酶II【ll12】等；2)有 些O-GlcNAc修饰位点与该蛋白的SerThr磷酸化修饰位点相毗邻。由于任何一种修饰的存在都势必会引起蛋白质该区域构象的改

22、变从而使另一种修饰的位点被4第一章前言覆盖住，所以这种情况下两种修饰依然存在竞争关系。如：波形蛋卧131，p531 41， 钙调蛋白激酶CAMKIVtl51和转录因子FOX0116，171等。3)也有些蛋白质的这两种 修饰位点既不重叠也不相邻，而是距离较远甚至分布于不同的结构域中，而且 在这些蛋白上可以同时存在有0GlcNAc矛D磷酸化修饰。如：胰岛素受体底物 IRS1 t181和心脏肌凝蛋白轻链191等。1212蛋白激酶和磷酸化酶的DGlcNAc修饰 修饰位点一致或相邻并不是OGlcNAc修饰和磷酸化修饰存在相互作用的唯一原因。事实上，许多蛋白激酶及磷酸化酶均存在着OGlcNAc修饰并且其活

23、性受该修饰所调节。例如，CAMKIV蛋白上有多个OGlcNAc#I磷酸化修饰位点， 其中有的位点位于ATP结合口袋中15】。磷酸化的CAMKIV处于活性状态，而 0GlcNAc修饰使CAMKIV对其底物ATP的亲和力降低，从而使其失去蛋白激酶 活性。利用定点突变方式将CAMK上主要的OGlcNAc修饰位点突变成Ala所得 到的CAMKIV突变体具有持久激酶活性。这或许是一种通过OGlcNAc修饰来防 止CAMKIV过度激活的调控方式。1213 OGT和OGA的磷酸化修饰 事实上，OGT和OGA蛋白均可以作为某些激酶(胰岛素受体，CAMK等)的底物而被磷酸化修饰【202¨。已有研究证实

24、，这种修饰对OGT糖基转移酶活性起到激活作用，并且很可能对OGT与其底物蛋白间相互作用产生一定的影响；然而磷酸化修饰对OGA起到何种作用仍不清剁22J。1220GlcNAc糖基化与其他翻译后修饰除磷酸化修饰外，OGlcNAc糖基化与其他翻译后修饰(乙酰化、泛素化、 甲基化等)很可能也有一定的相互作用。例如，在Serl49带有OGlcNAc修饰的 肿瘤抑制因子p53则不能被泛素化修饰【14，但同时也能阻止其Thrl55的磷酸化， 所以这种作用也可能是通过磷酸化间接完成的；细胞有丝分裂M期过量表达OGT 会使得组蛋白Iq3N乙酰化和甲基化水平发生变化，进而使该细胞分裂过程发生 紊乱231。多种蛋白

25、质可以同时受OGlcNAc及其他翻译后修饰的调控，但不同修 饰方式之间的相互作用机制还并未研究清楚。123O-GlcNAc糖基化的细胞生物学功能5第一章前言O-GlcNAc糖基化修饰影响蛋白质的结构和功能，赋予它们不同的生物学效 应，进而发挥着不同的细胞生物学功能。1231参与信号转导前己述及，O-GlcNAc修饰与磷酸化之间存在着相生相克的对立关系，而磷 酸化修饰又是信号转导过程中关键的环节，因此0一GlcNAc糖基化修饰在细胞信 号途径中的重要性也就不言而喻。如果将生命活动比喻成一个“电路”，磷酸化修 饰代表激活或关闭蛋白活性的“微型开关”，那么0GlcNAc糖基化修饰就是一个 “变阻器”

26、，通过调节细胞内信号通路以适应外界环境。“SerThr激酶是一类重要的信号转导分子，而SerThr的磷酸化修饰是信号 在胞浆与胞核传递的重要步骤”241。大量研究表明，许多SerThr激酶都带有 OGlcNAc糖基化修饰，在细胞的信号转导过程中扮演重要角色。例如，胰岛素 受体底物IRS1和Akt是胰岛素信号途径中重要的信号分子，Park等125】以 0GlcNase抑制剂PUGNAc处理小鼠脂肪细胞使IRS1和Akt的0GlcNAc水平升 高而磷酸化水平下降，致使糖原合成途径受阻、糖异生基因表达减少、葡萄糖 转运功能降低，最终抑制了细胞胰岛素信号途径，导致胰岛素抵抗现象的发生； “Matthe

27、w等以葡萄糖胺(DGlucosamine，GlcN)，链脲霉素(Streptozotocin，STZ) 以及0GlcNase抑制剂PUGNAc分别处理人星形胶质细胞以提高蛋白质 0GlcNAc水平，发现膜相关的PKCa矛IPKC吖表达量明显降低，而细胞膜正是 PKC的激活部位，因而显著抑制TPKC介导的信号转导途径”【261。但也曾有报道 细胞内O-GlcNAc的升高使流入HBP途径的糖量迅速增加，促进了PKC的磷酸化 从而增jJHPKC信号转导途径拉7|。1232介导应激反应通路 Zachara等人以高温、高盐、紫外线、低氧等一系列过激环境刺激细胞，发现任意一种刺激都导致细胞内蛋白DGlcN

28、Ac修饰水平明显升高【2 8，291。导致这种现象发生的原因是：在应激状态下，细胞对葡萄糖的摄取量显著增加。被吸收 进入细胞的葡萄糖，3-5流入己糖胺生物合成途径HBP从而生成0-GlcNAc转移 酶OGT的高能糖供体底物UDPGIcNAc，使得细胞内OGIcNAc修饰水平上升。 许多研究表明，体内0GlcNAc修饰的确能够帮助细胞抵抗环境压力及创伤【11 12。这种变化似乎是通过增加表达和减少降解两种方式共同帮助上调分子伴侣、6第一章前言热激蛋白的细胞内含量，从而提高细胞的应激能力。如果人为地通过OGA抑制 剂或其他方式提高细胞内0GlcNAc修饰水平，则细胞抵抗外界刺激的能力显著 增强。例

29、如，在动物模型中，线粒体蛋白的0GlcNAc修饰能够保护心肌免受心 脏病发作所导致的组织损伤【30,311。1233参与基因转录与翻译 目前已经知道，RNA聚合酶II及其众多转录因子如SPl、YYl、cMyc等都存在OGlcNAc修饰现象，且该修饰在基因转录过程中发挥着重要作用。 RNA聚合酶II为真核生物基因转录所必需，其C末端结构域CTD带有高度0GlcNAc修饰。Comer等【121认为，带有OGlcNAc修饰的CTD区域能够帮助RNA 聚合酶II与其他转录元件相互作用形成转录起始复合物。而转录延伸过程中该 0GlcNAc修饰必需选择性去除进而使CTD被广泛磷酸化，促进转录延伸因子与 R

30、NA聚合酶II的结合使后期转录延伸得以进行。同时，0GlcNAc修饰也能够保 护RNA聚合酶II免于降解，从另一方面利于基因转录的进行。Spl是一类重要的锌指类DNA结合转录因子，YaIlg等【32J发现DGlcNAc晰能够抑带lJSpl自身二聚体的形成及其与其他转录相关因子女ITATA区域结合蛋白 相关因子II 1 10(TATABinding Proteinassociated factorII 1 10)的结合，从而降 低其转录活性。另外，体内过量表达OGT也可以特异性地抑制细胞内Spl的转录 活性。但也有人报道Spl的OGlcNAc修饰可以促进基因转录的进行，Jackson等【3引 利

31、用麦胚凝集素特异性结合GIcNAc的原理从Hela细胞和E矗中分离纯化Spl， 发现其OGlcNAc修饰可以促进其介导的转录激活。Marjumdar等【34J以胰岛素处 理肝癌细胞，快速诱导Spl的OGlcNAc糖基化，发现该糖基化修饰可以促进Spl 定位于细胞核。随后在各种相关酶类的参与下，磷酸化代替糖基化而修饰Spl进 而促进钙调蛋白的基因转录。Goldberg等35】通过对OGT的基因敲除或过表达 OGA的方式降低肾小球系膜细胞内OGlcNAc修饰水平，发现由Spl介导的纤溶 酶原激活物抑制因子的基因转录被抑制。相反，利用OGA抑制剂PUGNAc处理 细胞，增加细胞内O。GIcNAc修饰

32、水平，则可以促进基因的转录。由此可见， OGlcNAc修饰可以通过不同的机制对Spl介导的基因转录进行调节，该调节机制 具有基因特异性。OGlcNAc修饰对于转录激活因子5(Signal Transducer and Activator ofTranscription，STAT5)介导的转录激活也起到关键作用。在细胞核中，只有7第一章前言OGlcNAc糖基化形式的STAT5才能够与转录共激活因子Creb结合蛋白(Creb Bmdmg Protein，CBP)结合从而激活靶基因的转录。利用质谱等相关技术， Gewinner等p6J发现，STAT5的OGlcNAc修饰存在于N端区域的Thr92上，

33、将这一 位点突变成Ala，则消除了其与CBP的结合，从而大大降低了STAT5的OGlcNAc 修饰水平及其对靶基因的转录激活。由此可见，OGlcNAc糖基化修饰为STAT5 介导的转录激活所必需。OGlcNAc修饰对蛋白质的翻译过程也起到不可忽视的调节作用。p67是真核 起始因子eIF2相关蛋白，其0GlcNAc糖基化形式可与eIF2结合形成较为稳定的 复合物，保护elF2免受磷酸化修饰而失活，从而保证真核生物蛋白质翻译的起 始。Ray,MK等【3 7】发现，去糖基化形式的p67贝J不能与elF2结合，eIF2被亚铁 血红素调节的蛋白合成抑制因子elF2激酶磷酸化而失活，蛋白合成被抑制。同 时

34、，失去了0GlcNAc修饰保护的p67蛋白本身也被降解。1234调节细胞周期 “细胞周期中蛋白质的OGlcNAc修饰水平是动态变化的。这一修饰具有周期时相依赖性，OGlcNAc水平在G1S、G2M期最高，M期处于最低水平”【241。但这种OGlcNAc修饰的周期性变化并不是一成不变的。例如，转录因子YYI矛H细 胞角蛋白18的OGlcNAc修饰水平在细胞M期显著增加。Slawson等【38】对OGlcNAc修饰对细胞周期的调节机制进行了研究。他们以 HBP途径中的限速酶GFAT抑制剂DON(6-DiazO5OxOLNorleucine)处理细胞 降低DGlcNAc修饰水平，则细胞通过S期和G2

35、M的速度明显加快，而在G1期的 时间延长，细胞被阻断在G1期。以OGA抑制剂PUGNAc处理细胞提高OGlcNAc 修饰水平，则细胞在M期的时间延长。可见，细胞内OGlcNAc修饰水平的动态 变化是细胞周期的一个重要调节机制。1235 OGlcNAc糖基化与蛋白质的流通与降解 蛋白酶体(Proteasomes)在真核生物和古细菌中普遍存在，其主要作用是降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质。SumeN M掣”J利用凝集素技术发现，黑腹果蝇的26S蛋白酶体的5个调节复合体亚基,t19个催化核心亚基都有0一GlcNAc 糖基化修饰的存在。哺乳动物细胞内，蛋白酶体19S帽子部分的Rpt2 ATPase受

36、 OGlcNAc修饰，该修饰可以抑制其ATPase活性和对转录因子Spl及一些疏水多8第一章前言肽底物的结合能力【40】。 COPII蛋白在蛋白质由内质网ER向高尔基体Golgi转运过程中的作用非常重要，而这种转运过程在细胞进行有丝分裂时是被抑制的。Dudognon，P等【4lJ发现， COPII蛋白的Sec24p组分在细胞间期带有广泛的O-GlcNAc修饰，而在进入有丝分 裂时，Sec24p的糖基部分被去除并被磷酸化修饰。这种DGlcNAc与磷酸化的循 环修饰很可能参与调节COPII蛋白对上述蛋白转运过程的抑制作用。另外， O-GlcNAc修饰广泛存在于多种核孔蛋白上，这很可能与有丝分裂过程

37、中核孔的 装配及分解过程相关。124OGlcNAc糖基化与疾病研究表明，OGlcNAc修饰及其与磷酸化相互作用的异常与II型糖尿病、阿 尔兹海默症、癌症等多种疾病密切相关(图12)。裁钧赣媛港。 鬻甏绺山蘸胬糍6-磷酸山聚穗一6攘酸氮基酸代一蜒扩扩鬣果特磷酸酰一酶脂肪酸代” 争乙酰辅酶4乙酰鼋麓胺_6一磷酸上乙酰秘懿技一卜磷酸譬、=群数4i澎一琏j；三冁N基因转蜀K嚣葬慧痊，细胞周期，稳译珏疆麓霖霸癌症图12己糖胺合成途径为O-GlcNAc修饰提供高能糖供体西第一章前言1241 O-GlcNAc修饰与糖尿病 目前，糖尿病发病率逐年升高，已成为世界公认的人类健康第三大杀手。糖尿病患者中有95为非

38、胰岛素依赖型糖尿病即II型糖尿病。该类型糖尿病的显 著特征为胰岛素抵抗，即胰岛素的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，导致正 常剂量的胰岛素产生低于正常生物效应的一种状态。大量研究表明，胰岛素抵抗的发生与OGlcNAc修饰密切相关(图13)。在 型糖尿病患者体内的高血糖环境下，胰岛分泌的胰岛素与细胞表面的胰岛素 受体(Insulin Receptor，IR)结合后使IR被激活。这时，OGT被招募至细胞膜内表 面且被瓜磷酸化而激活，进而OGT糖基化IRS一1、p85、PDKl、Akt等糖代谢途径 中的一系列关键蛋白，导致胰岛素信号途径受阻，产生胰岛素抵抗现象。该过 程使得细胞糖摄取量更加减少而糖异生

39、途径加强，进一步诱导高血糖，最终导 致恶性循环20,42,43】。胰岛素抵抗胰岛素抵抗图13胰岛素抵抗现象的发生1242 OGlcNAc修饰与神经退行性疾病 OGlcNAc修饰在脑中含量尤为丰富。越来越多研究表明，阿尔兹海默症(AlzheimerS disease，AD)、帕金森综合症等神经退行性疾病患者脑中多存在糖代谢缺陷现象。例如，在正常人脑中微管相关蛋白Tau蛋白的多个位点均带有 O-GlcNAc修饰，而在阿尔兹海默症患者脑中Tau蛋白的OGlcNAc糖基化明显不 足且被异常过度磷酸化，进而多聚化形成神经元纤维缠结，引起AD的典型病理 变化。ODonnell等M在小鼠体内过量表达OGT，

40、使Tau蛋白OGleNAe水平上升， 随后引起其磷酸化水平明显降低，缓解了AD病情。相反，对OGT进行基因删除 则导致Tau蛋白的高度磷酸化，进而使病情恶化。另外，OGlcNAc修饰也与帕金森综合症关系密切。例如，在人类细胞中，10第一章前言编码OGT的基因定位于X131，恰好与帕金森综合症的肌张力障碍的基因位置相 吻合；“OGA基因定位于10q24，与阿尔兹海默症及其他一些神经性疾病的染色 体定位相对应，这也进一步提示了蛋白质的DGlcNAc修饰与神经退行性疾病之 间的密切联系，45。1243 0GlcNAc修饰与癌症0GlcNAc修饰与磷酸化修饰有着广泛的相互作用，而磷酸化修饰又在许多 肿

41、瘤发生与转移过程中扮演重要角色，那么0GlcNAc修饰也与癌症发生过程密 切相关也就不足为奇。许多致癌基因和肿瘤抑制因子都在转录调节过程中发挥 直接作用。研究表明，几乎所有的这类蛋白质都受0GlcNAc修饰的调控，例如 p531 41、cMyc8,46、Rb471、B连环蛋纠481、雌激素受体ER9，49，501等。肿瘤蛋白cMyc的Thr58是该蛋白上主要的OGlcNAc修饰和磷酸化位点， 而该位点也正是人淋巴瘤的突变热点之一【引。Kamemura，K等【51经研究发现，当 细胞处于未分化状态时，cMyc的Thr58位点带有OGlcNAc修饰，而利用血清 刺激其生长时，Thr58被迅速磷酸化

42、。这些结果显示，cMyc的OGlcNAc与磷 酸化修饰参与调节其亚细胞定位及其在细胞内的多种功能。易感性的视网膜母细胞瘤基因产物(Retinoblastomasusceptibility gene product，Rb)是典型的肿瘤 抑制因子，其对细胞增殖、分化及细胞凋亡等过程的调节也与OGlcNAc及磷酸 化修饰相关。转录因子e2f-1所介导的基因转录为细胞进入S期所必需， OGlcNAc的Rb可以通过与e2f-1结合来抑制其介导的转录激活。细胞在G1中末期阶段，Rb的OGlcNAc修饰会被去除，取而代之的是磷酸化修饰。磷酸化 的Rb不能与e2f-1结合而失去其抑制能力，从而使e2f-1介导

43、的转录激活，细胞 进入S期47】。另外，“肿瘤抑制蛋白p53的OGlcNAc修饰可通过抑制其泛素化 降解，增加p53的稳定性。转录因子NFr,B受OGlcNAc修饰后，可影响其与IKB(inhibitor ofNF1(B)的相互作用，进而影响其核定位”【52|。众多结果显示，0GlcNAc修饰在癌症病理中发挥不容忽视的作用。 事实上，除以上疾病外，OGlcNAc修饰还与心血管疾病以及病毒侵染等过程密切相关。因此，对OGlcNAc修饰及参与该动态过程调控的酶类的研究至关重要。第三节N乙酰氨基葡萄糖(OGIcNAc)转移酶OGT11第一章前言虽然OGlcNAc糖基化修饰与磷酸化有着广泛的相互作用，

44、且其修饰位点及 动态过程与磷酸化相似。但“与磷酸化所不同的是，控制DGlcNAc糖基化修饰的 添加和移除的酶只有两种：-乙酰氨基葡萄糖转移酶OGT和-乙酰氨基葡萄糖 苷酶OGA。其中，OGT负责OGlcNAc的添加，而0GA负责OGlcNAc的移除， 两者共同调控OGlcNAc修饰的动态平衡过程，531(图11)。1310GT的一般特性OGT最早发现并纯化于小鼠的肝脏细胞中，该OGT以异源三聚体形式存在， 其中包含两个分子量为1 10KD的亚基(nCOGT)和一个78KD(sOGT)的亚基，另 外，线粒体中还存在一种分子量为103KD的OGT蛋白(mOGT)。OGT主要包含 两个结构域：含有多

45、个三十四肽重复序列的N端TPR结构域以及具有OGlcNAc 糖基转移酶活性的C端催化结构域。研究者们认为，其N端TPR结构域主要参与 蛋白底物的识别作用，而C端催化结构域则负责GlcNAc的添加。编码OGT的基 因位于X染色体靠近着丝粒的位置。人们已经分别从小鼠、人类和线虫等生物体 内克隆得到编码OGT的基因，发现不同生物体中该蛋白的一级序列呈高度保守。 OGT的mRNA和蛋白表达水平呈组织特异性和细胞信号通路依赖性。然而OGT 的活性并不总是与其mRNA和蛋白表达水平相关，而是常常受到供体底物浓度、 翻译后修饰和多聚化等其他不同因素的影响。其中，供体底物浓度对于OGT的 活性影响最为显著。细

46、胞内供体底物UDPGlcNAc浓度的升高能够增jJIOGT对其 多肽底物的亲和力，而UDPGlcNAc的细胞内浓度又精确受控于糖类、脂肪酸、 能量等物质的代谢。事实上，进入体内的葡萄糖有25经过HBP途径生成 UDPGlcNAc，敏感受控于UDPGlcNAc浓度的OGT通过控制其底物蛋白的 OGlcNAc修饰水平参与调控胰岛素信号途径、基因转录与表达等各种糖代谢相 关途径，这使得OGT催化的OGlcNAc修饰成为一种理想的细胞营养代谢感应器 (图12)。132OGT的晶体结构全长人源OGT晶体结构的难于获得一直是对OGT深入研究的主要障碍。 “Jinek等得到了OGT的N端结构域的晶体结构，该

47、段结构只包含115个TPR序列， 而不含有催化区域；经研究发现，Nup62蛋白与OGT的结合位点就位于这段结构 内，且其能够与全长OGT市H互竞争结合其底物蛋白。这段TPR结构以右手螺旋的第一章前言方式形成二聚体，而非肝脏中全长OoTN_=聚体形式5 51。超螺旋表面的疏水相 互作用促使其二聚体的形成，其中异亮氨酸和色氨酸在该过程中起到了重要作 用，经证实这两个氨基酸的突变会导致该二聚体的解聚541。OGT的TPR序列会 形成各种不同的沟状结构，使其可以特异性识别不同的底物蛋白。许多天冬酰 胺分布于该沟状结构中心”54， “这些天冬酰胺能与底物的主链形成氢键，这 对于OGT的底物识别有着十分重

48、要的作用561。天冬酰胺周围的氨基酸组成则决 定了OGT的底物特异性”54。Michael等【5，J利用分子生物学技术构建了含有N端45个TPR结构,Hc端完整 催化区域的hOGT45，并获得了其晶体结构。该晶体结构表明， “OGT的催化区 域包含三个结构域：N端催化区域(Ncat)、中间结构域(IntD)和C端催化区 域(Ccat)。除Ncat和Ccat区域均含有的GTB型糖基转移酶Rossmann样折叠， Ncat区域还包含两个额外的0c螺旋H1,H142，二者共同构成OGT活性位点的主要 组成部分。“在Ccat中与Ncat结构域接触面附近有一个疏水口袋，hOGT45与核 苷二磷酸(UDP

49、)共结晶显示，UDP就结合于该疏水口袋中，这与早些报道的 UDP结合于OGT的CD I区域有所不同”【5860】。OGT的N端TPR和C端催化结构域 通过一个过渡性0【螺旋H3fN连，该螺旋位于C端催化区域的上表面，沿着由Ccat 至Ncat的方向螺旋盘绕。OGT的催化区域中有两个高度保守的组氨酸残基 (His498和His558)，为OGT催化反应所必需。全长人源OGT晶体结构的缺乏严 重阻碍了其相关研究工作的进展，该hOGT4 5晶体结构的获得将对OGT的分子作 用机制、底物特异性等相关研究起到十分重要的推动作用”【5 3|。133 OGT的自身OGlcNAc修饰研究表明，OGT不仅可以糖

50、基化其多肽或蛋白底物，同时能够进行自身 OGlcNAc糖基化修饰6163】。Lubas等611体外表达OGT的不同截短类型，利用免 疫印记技术检测到OGT带有自身OGlcNAc糖基化修饰，且这种现象在N端缺失6 个TPR序列的sOGT中最为显著。Riu等【62】采用类似方法同样也检测到了体外 sOGT的自身糖基化现象。Kang=等t63】以糖饥饿处理肺癌细胞，发现其细胞内蛋白 的OGlcNAc修饰水平明显升高，相反OGT的自身OGlcNAc修饰水平却有所降 低，这可能是由于OGlcNAc修饰使OGT的某些性质发生了改变。虽然已有研究证实OGT可以进行自身糖基化修饰，但该修饰对OGT的具体 调节

51、机制及其在体内起到何种作用还并不清楚。13第一章前言第四节研究内容及意义O-GlcNAc糖基化修饰是生物体内十分重要的一种蛋白质翻译后修饰。与其 他糖基化修饰方式不同，OGlcNAc修饰同时广泛存在于胞核和胞质中。目前已 知可以被其修饰的蛋白已有上千种之多，随着该修饰检测技术的改善，科学家 们将会发现更多的OGlcNAc修饰蛋白。这些蛋白几乎参与所有的细胞途径， OGlcNAc修饰赋予它们特定的生物学效应，进而调控体内各种细胞过程。近年来，OGlcNAc修饰及其转移酶N乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)成为 糖生物学领域的研究热点。研究表明，OGT不仅能够糖基化其蛋白或多肽底物，同时也可以进行自身

52、 OGlcNAc糖基化修饰，但是目前关于这方面的研究还少之甚少。本文利用大肠杆菌表达系统及镍亲和层析方法得到了纯度较高、活性较好 的sOGT蛋白；借助LCMS、定点突变PCR、Western Blot(WB)等技术实现TsOGT 蛋白上6个OGlcNAc修饰位点的定位；分别以十七肽CKII、Nup62蛋白为底物 初步探索了OGlcNAc修饰对sOGT功能的影响。此项研究对于理解OGT对细胞途 径的调节机制起到很大帮助作用，并为今后这方面的研究工作提供了科学依据。14篁三至垫整兰查鲨第二章材料与方法第一节实验材料211菌株大肠杆菌克隆菌株DH5 0【及表达菌株BL21为本实验室保存。 212基因片段 mOGT全基因片段由GENEART公司全合成。213主要试剂表21实验试剂及耗材名称来源酵母提取物、胰蛋白胨美国Oxoid公司氯化钠、甲醇、冰乙酸天津北方天医化学试剂厂 氨苄青霉素、硫酸卡那霉素北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 异丙基移D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 限制性内切酶Fermentas公司溶菌酶、DNAse I北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司T4 DNA连接酶Fermentas公司Taq DNA聚合酶天根生化科技有限公司高纯度