EGCG对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的抑制效应及机制初探

1、.EGCG对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的抑制效应及机制初探【摘要】本研究探讨绿茶茶多酚成分之一表没食子儿茶素没食子酸酯()epigallocatechin3gallate，EGCG)对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的影响及其机制。体外培养多发性骨髓瘤细胞KM3，观察不同浓度EGCG作用后的培养上清对血管内皮细胞株HUVEC迁移和形成血管能力的影响。ELISA法检测KM3细胞培养上清中血管内皮生长因子（VEGF）分泌水平；RTPCR方法检测KM3细胞VEGFmRNA表达水平。结果表明：EGCG以浓度依赖方式抑制KM3细胞培养上清促内皮细胞迁移的作用，5,25,50和100mol/

2、L的EGCG迁移细胞数目分别为41427，29970，20242及11613个，且EGCG的浓度与内皮细胞的迁移数目呈负相关（r=-0.952,p0.05）。同时，内皮细胞形成小管的面积随EGCG浓度的升高而减少，25及50mol/L时的面积分别是88343.93231.1和60897.5914.1m2，均明显低于对照组（p0.01)，小管面积与EGCG浓度呈负相关（r=-0.888,p0.05）。5、25、50、100mol/L的EGCG作用于KM3细胞48小时后培养上清中VEGF的含量分别为1399.047.4pg/ml，660.15.7pg/ml，108.55.8pg/ml和26.218

3、.6pg/ml，与对照组比较，25、50、100mol/L组均有统计学意义（p0.01）。RTPCR结果显示EGCG抑制KM3细胞VEGF的mRNA水平表达，且呈浓度依赖性。结论：EGCG能显著抑制多发性骨髓瘤细胞KM3的促血管新生作用；下调VEGF转录水平的表达，减少VEGF的分泌可能是其药理作用机制之一。医学论文网【关键词】多发性骨髓瘤InhibitoryEffectofEGCGonAngiogenesisInducedbyMultipleMyelomaCelllineKM3andItsMechanismSHAOJing,CHENZhiChao,LIQiuBai,LJianInstitut

4、eofHematology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,ChinaAbstractTheaimofthisstudywastoinvestigatetheeffectof(-)epigallocatechin3gallate(EGCG)onangiogenesisinducedbymultiplemyelomacelllineKM3anditsmechanism.TheeffectsofKM3cellsupernatantafterbeingtre

5、atedwithEGCGindifferentconcentrationsonmigrationandvascularformatiemabilityofendothelialcelllineHUVECwereinvestigatedthroughcultureofMMcelllineKM3invitro.Thesecretionlevelofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inKM3cellsupernatantandtheexpressionlevelofVEGFmRNAinKM3weredetectedbyELISAandRTPCRrespect

6、ively.TheresultsindicatedthattheKM3cellsupernatantsignificantlyinducedendothelialcellmigrationandvasselformationinvitro.EGCGinhibitedtheeffectofendothelialcellmigrationinducedbyKM3cellsupernatant,andthenumbersofmigratedcellswere41427,29970,20242and11613at5,25,50,100mol/Lrespectively.Thenumbersofmigr

7、atedcellsshowednegativecorrelationwiththedoseofEGCG(r=-0.952,p0.05).TheareasofthecapillarylikestructuresdecreasedwhiletheconcentrationsofEGCGincreased,88343.93231.1m2at25mol/L,60897.5914.1m2at50mol/L,whichweresignificantlylessthanthatinthecontrol(p0.01）andshowednegativecorrelationwiththedoseofEGCG(r

8、=-0.888,p0.05).48hoursaftertreatmentwithEGCGatconcentrationsof5,25,50and100mol/L,thelevelsofVEGFintheculturesupernatantwere1399.047.4，660.15.7，108.55.8and26.218.6pg/mlrespectively.Except5mol/L,alltheothergroupsshowedsignificantchangeswhilecomparedwiththecontrols(p1.8）和含量。取总RNA2l，Oligo(dT)1l,DEPC水补充至

9、12l，70预热5分钟，再依次加5buffer4l，RNA酶抑制剂1l，10mmol/L的dNTP2l，37孵育5分钟，再加逆转录酶1l，42，60分钟，停止反应。VEGF的引物序列正义链5TGCCTTGCTGCTCTACCTCC3，反义链5TCACCGCCTCGGCTTGTCAC3，产物VEGF121409bp，VEGF165613bp。actin的引物序列是正义链5GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT3,反义链5TGATCCACATCTGCTGGAAGGT3,扩增产物141bp。取2lcDNA，加10buffer2.5l，Taq酶1l，dNTP0.5l，MgCl21l，VEGF

10、或actin上下游引物各1l，用DEPC水补充体积至25l。反应采用SDPCR程序5，94预变性5分钟，94变性1分钟，退火温度自65开始，以3幅度递减至53，每个温度退火2分钟，72延伸1分钟，4个循环，5个温度共20个循环，然后以50为退火温度进行12个循环，最后72充分延伸7分钟。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外光显影。统计学分析实验数据以SD表示，应用SPSS12.0统计软件，组间分析采用两独立样本的t检验及相关分析方法进行处理。结果EGCG对KM3细胞培养上清诱导的内皮细胞迁移的抑制作用从阴性对照组可以看出，内皮细胞本身具有一定的迁移能力，而未经EGCG作用过的KM3细胞培养上清能

11、明显促进内皮细胞的迁移、细胞数增加。经不同浓度EGCG作用48小时的KM3细胞培养上清对内皮细胞的迁移效应明显低于阳性对照组，迁移细胞的数目随着EGCG药物浓度的升高而减少（图1）。阳性对照组与阴性对照组，EGCG药物作用组与阳性对照组之间相比较均有统计学意义（p0.01）（表1）。内皮细胞迁移数目与EGCG药物浓度的直线相关性分析结果显示，二者呈负相关（r=-0.952,p0.05）。EGCG对KM3细胞培养上清诱导的内皮细胞小管形成的抑制作用未经EGCG作用的KM3细胞培养上清能诱导内皮细胞在Matrigel上形成小管状结构，逐渐成网状相连。与阴性对照相比，管腔完整，数目多。经不同浓度EG

12、CG作用48小时的KM3细胞培养上清对内皮细胞的小管形成效应明显低于阳性对照组，管腔面积随着EGCG药物浓度的升高而减少，100mol/LEGCG作用组已无完整的管腔形成（图2）。阴性对照组与阳性对照组，25、50mol/LEGCG药物作用组与阳性对照组之间相比较均有统计学意义（p0.01）（表2），内皮细胞形成小管的面积与EGCG药物浓度之间呈负相关（r=-0.888,p0.05）。讨论表没食子儿茶素没食子酸酯()epigallocatechin3gallate,EGCG)是绿茶茶多酚的一种主要成分，具有多种生理活性和药理效应。众多的研究表明，EGCG在肿瘤的防治中有重要作用，其抑癌机制包括

13、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和下调Bcl2蛋白的表达6。EGCG还能强烈抑制端粒酶的活性，引起肿瘤细胞端粒的缩短、染色体的改变和对与细胞寿命相关的半乳糖苷酶的表达的抑制7。另外也有研究表明,EGCG可诱导骨髓瘤细胞的凋亡，其机制与线粒体膜电位的下降，细胞色素C、Smac/DIABLO和AIF从线粒体的释放及升高胞内活性氧水平相关8。由此证实，EGCG对MM也有较强的抗肿瘤作用。EGCG除上述的抗肿瘤效应外，还有研究表明在乳腺癌等肿瘤中具有抗血管新生的作用9，10。血管新生在MM的发病中有重要意义，并和预后密切相关，以抗血管新生为靶点的治疗已成功的应用于临床11。EGCG是否可抑制MM的促

14、血管新生作用目前尚无报道。本实验采用内皮细胞迁移和小管形成实验证明，MM细胞的培养上清具有明显的促内皮细胞迁移和小管形成的作用，而经不同浓度的EGCG作用后的MM细胞上清诱导内皮细胞迁移和小管形成的能力是逐渐减弱的，且呈浓度依赖性，说明在体外实验中EGCG可明显抑制MM细胞诱导的血管新生作用。肿瘤的血管新生有赖于肿瘤细胞分泌的血管新生因子与内皮细胞的相互作用。VEGF作为血管新生中重要的正调控因子已发现在MM细胞系及来源于患者的瘤细胞中高表达12，其mRNA通过不同的剪切方式产生了5种不同的异构体，其中VEGF165在体内最常见，除可存在于细胞表面或细胞外基质中，还可分泌至细胞的培养上清中。在

15、体内，VEGF通过存在于内皮细胞上的VEGF受体特异性作用于血管内皮细胞的有丝分裂，刺激血管内皮细胞增殖和迁移促进新生血管生长13。本实验通过ELISA方法检测MM细胞培养上清中VEGF的含量显示，经25mol/L的EGCG作用48小时后上清中的VEGF浓度即有明显下降，且与EGCG呈浓度依赖性。从mRNA水平的检测可以看到，EGCG对VEGF在转录水平的作用与蛋白分泌水平结果一致，即在转录水平抑制了VEGF的表达，从而减少蛋白的分泌，明确了EGCG抑制MM细胞的促血管新生作用可能是以抑制促进血管新生因子VEGF表达为机制，从而阻断其与内皮细胞上特异受体的结合，激活下游的信号传导及相应的生物学

16、效应。本研究初步探讨了EGCG抑制MM血管新生作用及其机制，但其上游调控机制和是否存在其他机制尚不清楚，这些均有待进一步的研究。绿茶是国人所喜爱的传统保健饮料之一，EGCG作为绿茶茶多酚的一种，来源广泛。深入研究其对MM的抗肿瘤机制和药理效应，对开发新的抗MM药物有重要意义。【参考文献】1VaccaA,RibattiD,RoncaliL,etal.Bonemarrowangiogenesisandprogressioninmultiplemyeloma.BrJHaemato1,1994;87:503-5082RajkumarSV,FonsecaR,WitzigTE,etal.Bonemarro

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18、68054YahataY,ShirakataY,TokumaruS,etal.NucleartranslocationofphosphorylatesSTAT3isessentialforvascularendothelialgrowthfactorinducedhumandermalmicrovascularendothelialcellmigrationandtubeformation.JBiolChem,2003;278:40026-400315HeckerKH,RouxKH.Highandlowannealingtemperaturesincreasebothspecificityan

19、dyieldintouchdownandstepdownPCR.Biotechniques,1996；20:478-4856潭晓华,张亚历,周殿元等.EGCG诱导胃癌和肝癌细胞凋亡及bc12表达下调的研究.癌症,2000;19:638-6417NaasaniI,SeimiyaH,TsuruoT.Telomerasaeinhibition,telomereshortening,andsenescenceofcancercellsbyteacatechins.BiochemBiophysResCommun,1998;249:391-3968NakazatoT,ItoK,IkedaY,etal.Greenteacomponent,catechin,inducesapoptosisofhumanmalignantBcellsviaproductionofreactiveoxygenspecies.ClinCancerRes,2005;11:6040-60499SartippourMR,ShaoZM,HeberD,etal.Greenteainhibitsvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inductioninhu