大肠杆菌及大肠菌群计数方法

1、大肠杆菌和大肠菌群计数方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌（除双壳类软体动物制品外）瓶装水检测方法贝类和贝类肉制品检测方法柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法参考文件大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细

2、菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。与已知的非产气致病菌容易区别开来。 因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指

3、标，在实际应用中很复杂 。于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5进行，其他所有食品都在45.5进行。粪大肠菌群包含绝大部执蟪司? 克雷伯氏菌也作为粪大肠菌群,

4、但克雷伯氏菌的检出被认为与粪便污染并无关系。因此,大肠杆菌又被作为一个重要指标。快速鉴定大肠杆菌的新方法采用，使检测大肠杆菌相对容易了。现在,在不同的应用中,大肠杆菌,大肠菌群和粪大肠菌群这三种类型作为污染指标。大肠菌群常用于水或食品加工过程中卫生状况的指标。粪大肠菌群用于贝类和贝类养殖水的标准指标。大肠杆菌用于近期粪便污染或不卫生的处理过程指标。几乎所有的检测方法都是基于发酵乳糖。最可能数值法(MPN)是一种统计学方法,包括近似确证和完全验证。在检测过程中,样品要进行系列稀释。实验操作要记录发酵乳糖产气的阳性管数,然后进行另外两步实验,利用阳性结果查统计表(见附录2),估计细菌的数量,仅前两

5、步用于检测大肠菌群和粪大肠菌群,所有三步用于检测大肠杆菌。3管 MPN法用于检测大部分食品,5管 MPN法用于检测水,贝类和贝类养殖水。10管 MPN法用于检测瓶装水或估计本样品为受到严重污染.另外还有一种固体平板计数法,使用VRBA培养,其含有中性红作指示剂,当发酵乳糖时产生红色菌落。还有一种膜过滤法检测大肠菌群和粪大肠菌群,主要根据发酵乳糖产酸形成不同的菌落颜色。本章节也介绍荧光法检测大肠杆菌；检测贝类的特殊方法；一种简单的瓶装水检测方法；和一种与HACCP法规中相关的检测柑桔类水果汁中大肠杆菌的方法.1. 传统方法检测大肠菌群、粪大肠菌群、和大肠杆菌A设备和材料1.水浴箱：44.5

6、77;0.2，水浴箱中的水应高于试管中的培养基液面。2.插入型温度计：1-55，大约长55cm，精度为0.1，必须经NIST或相关部门检测合格3.培养箱：35±1.04.电子天平：感量0.1g，称量范围大于2Kg5.均质器或均质瓶（见第1章）6.无菌吸管：1.0ml和10.0ml7.无菌器皿：（用于样品处理）8.无菌稀释用带盖玻璃瓶9.菌落计数器或同等产品10.长波紫外灯:（-365nm）不超过6w11.PH计B培养基和试剂煌绿乳糖胆盐肉汤，2% （M25）LST肉汤（M76）EC肉汤(M49)L-EMB琼脂（M80）胰蛋白胨（色氨酸）肉汤（M164）MR-VP肉汤（M104）Kos

7、er枸橼酸盐肉汤（M72）PCA（标准方法）（M124）Butterfields磷酸盐缓冲液（R11）或同等稀释液（贝类除外）Kovacs试剂（R38）V-P试剂（R89）革兰氏染色液（R32）甲基红指示剂（R44）结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）（M174）VRBA-MUG琼脂（M175）EC-MUG培养基（M50）LST-MUG肉汤（M77）0.1%蛋白胨水稀释液（R56）C、MPN法用于大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的计数称取50g样品加入高速捣碎杯中，见第1章或现在FDA器械 。冷冻样品在2-5解冻(18h)，但不要融化。加入450ml 磷酸盐缓冲液，搅拌2分钟，如果样品量小于50g，

8、称取一半样品加入足够体积的无菌稀释液，制成1：10的样品液，在捣碎杯中的液体应完全覆盖刀片。稀释倍数根据大肠菌群对样品的污染情况，用稀释液将样品制成一系列十倍递增的样品稀释液，以30cm幅度于7s内将样品振摇25次（或以器械振摇器震荡）。选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种3管LST，每管接种1ml，以一定的角度，使吸管的尖部在试管壁上停留2-3s，从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不要超过15min。（注意：用5管MPN法检测贝类食品和贝类养殖水）将接种的LST管放置35培养，检查和记录在24±2h时倒管内产气的试管，未产气的试管继续培养24h，在48±2h

9、时检查和记录产气情况，对所有产气的试管进行确证试验。D、MPN法大肠菌群确证试验将所有LST肉汤产气管，用接种环接种一环到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤中。置BGLB试管于35培养48±2h，记录所有BGLB肉汤管的产气管数。按BGLB肉汤产气管数，查MPN表（见附录2 ），计数出大肠杆菌的最可能数值。E、MPN法粪大肠菌群和大肠杆菌确证试验从产气LST肉汤管中接种一环培养物到EC肉汤管中（木制接种棒也可以使用）。将所有接种的EC肉汤管放入带盖水浴箱中，45.5培养24±2h，检查产气情况。如果不产气，继续培养至48±2h，检查产气情况。按产气管数，查MPN表计数出

10、粪大肠菌群MPN值。继续大肠杆菌分析，按以下F部分进行。EC肉汤MPN方法可用于海水和贝肉类的粪大肠菌群检测。注意：除水、贝类和贝类养殖水中的粪大肠菌群检测的培养温度为44.5±0.2外，其他所有食品中粪大肠菌群的培养温度为45.5±0.2。F、MPN法大肠杆菌的完全测定进行大肠杆菌完全测定前，轻轻摇匀产气的EC肉汤试管，取产气管的培养物划线接种于伊红美蓝平板（L-EMB），35培养18-24h，检查L-EMB平板上有无具黑色中心的有金属光泽或无金属光泽的扁平菌落。挑取5个典型菌落接种到PCA斜面培养基上，35培养18-24h，进行进一步检测。注意：检测5个可疑菌落中任何一

11、个为大肠杆菌，都可以确证EC肉汤管为阳性。因此，并非5个菌落都必须检测。革兰氏染色：所有为革兰氏染色阴性短杆菌的培养物，都应进行IMVIC生化反应检测和重新接种到LST肉汤进行产气确证试验。吲哚试验：将PCA斜面纯培养物接种到胰蛋白胨肉汤中，35培养24±2h，加Kovacs氏试剂0.2-0.3ml。上层出现明显红色为靛基质阳性反应。VP试验：将纯培养物接种到MR-VP肉汤中，35培养48±2h，以无菌操作称取培养物1ml至13*100mm试管中，加入0.6ml-萘酚溶液，0.2ml 40%KOH溶液和少许肌酸结晶。振摇试管后静置2h。如出现伊红色，为VP阳性反应。甲基红试

12、验：在VP试验完后，试管中MR-VP培养物剩余部分继续在35培养48±2h；滴加5滴甲基红溶液，培养物变为明显红色为甲基红试验阳性，若变为黄色则为阴性反应。柠檬酸盐试验：接种纯培养物到KoserS枸橼酸盐肉汤中清澈液体，避免接种量过量产生浑浊。35培养96h，培养物为明显浑浊为阳性反应。发酵乳糖产气试验：接种纯培养物到LST肉汤中，35培养48±2h，产气或轻轻摇动试管产生气泡为阳性反应。结果报告：所有培养物（A）在35培养48±2h内发酵乳糖产酸产气（B）革兰氏阴性无芽孢杆菌 （C）IMVIC试验为+ + - -或- + - -为大肠杆菌。再根据EC肉汤中阳性管

13、数（连续3个稀释度）查MPN表（见附录2）计算出每克（毫升）样品大肠杆菌MPN值。注意：可以选用API20E或VITEK生化分析，鉴定大肠杆菌，替代IMVIC生化试验。G大肠菌群固体培养基测定法按照生产厂家说明制备结晶紫中性红琼脂（VRBA）冷至48时备用。样品制备按照以上I.C部分制备。每个稀释度分别移取2个1ml样品液到2个灭菌平皿中,根据细菌受损和挤压的程度。取10ml冷至48的VRBA培养基加入平皿中，小心旋转平皿，将培养基与样品液充分混匀。待琼脂凝固后，再加入5mlVRBA培养基覆盖平板表层，以防止细菌蔓延生长。如果细菌细胞受损严重，需要复苏修复，取8-10ml冷至48的胰蛋白胨大豆

14、琼脂，将培养基与样品液充分混匀，在室温中放置2±0.5h，再加入8-10ml冷至48的VRBA培养基覆盖平板表层。把凝固后的平板，35倒置培养18-24h，检测乳制品时，放置32培养18-24h，用带光源的放大镜下检查平板。选用有25-250个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群，典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。为了确证大肠菌群，从VRBA平板至少挑取10个典型菌落，接种于BGLB肉汤内，35培养24h和48h，观察产气情况。注意：将出现产气的BGLB肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管应进行革兰氏染色，以便挑除革兰氏阳性杆菌。每克

15、样品中的大肠菌群数量等于经最后证实为阳性的试管百分比乘以VRBA上的可疑菌落，再乘以稀释倍数。另外一种方法：大肠杆菌可以与大肠菌群进行区别，在每毫升VRBA覆盖琼脂中加入100ug MUG，经培养后，大肠杆菌在长紫外灯下出现蓝色荧光。（详见LST-MUG部分）H、膜过滤法(MF)检测大肠菌群：见部分，瓶装水检测。注意：由于大多数食品容易粘在膜上，因此，MF法最适合于检测水样品，MF法也可用于含微量颗粒少的液体食品。.LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中大肠杆菌(除双壳类软体动物制品外)LST-MUG法原理基于-葡萄糖苷酶能降解MUG成4-MU，在长紫外灯下时（365nm），MU在菌落周围培养基

16、显示出蓝色荧光，非常容易辨别。95%以上的大肠杆菌产生-葡萄糖苷酶（包括一些不产气的菌株），而大肠杆菌O157：H7不产生此酶。经常通过-葡萄糖苷酶来区别大肠杆菌与大肠杆菌O157：H7，虽然-葡萄糖苷酶阳性的O157：H7确实存在。肠杆菌科中除了一部分志贺氏菌（44-58%）和沙门氏菌（20-29%）含有此酶以外，其他细菌都不含有此酶。因此，从公共卫生角度来分析，并不认为通过-葡萄糖苷酶来检测致病菌出现疏忽是一个缺点。-葡萄糖苷酶的活性是受催化抑制影响的，有些大肠杆菌为-葡萄糖苷酶阴性，甚至有时携带有编码这个酶的Vida基因。然而，在研究表明，大约96%的大肠杆菌为-葡萄糖苷酶阳性而不需要此

17、酶的诱导。除一些培养基外，例如EMB培养基，含有一些荧光物质，会掩盖MU荧光，MUG能加入几乎任何培养基中进行大肠杆菌检测。当MUG加入LST中后，大肠菌群可以通过发酵乳糖产气进行检测，大肠杆菌可以在长紫外灯光观察荧光进行检测，这样可以在24h内进行大肠杆菌近似鉴定。LST-MUG培养基已经被AOAC作为对除贝类外的冷藏和冷冻食品的大肠杆菌检测。对于MUG分析的方法可联系Peter Feng博士、FDA、CFSAN、大学公园、MD、20740、301-436-1650注意：观察LST-MUG试管的荧光时，应在黑暗处长紫外灯（365nm）下，手提式6w的紫外灯完全可以满足要求且非常安全。当使用更

18、大功率的紫外灯时，例15w紫外灯，应带上防紫外线的眼镜和手套。同时，在采用MUG方法前，检测所有玻璃试管是否本身含有荧光，有时二氧化铈加入玻璃中进行质量控制检测，在紫外灯下会产生荧光，干扰MUG检测。因此，在MUG检测方法中，把阳性菌株和阴性菌株进行对照非常必要。1、 设备和材料：见前面部分I.A玻璃试管：新的、一次性（100*16mm）玻璃试管：新的、一次性（50*9mm）长紫外灯6w或相当的。2、 培养基和试剂：见前面部分I.B3、 LST-MUG法近似检测大肠杆菌除了LST-MUG肉汤代替LST肉汤外,样品制备和检测过程与前面部分I相同,需用-葡萄糖苷酶阳性大肠杆菌(ATCC25922)

19、和阴性肠杆菌(ATCC13048)作对照。35培养24至48±2h,检查产气和浑浊的试管，然后在长紫外灯下(365nm)观察荧光，呈现蓝色荧光的为大肠杆菌假定阳性。Moberg研究表示，使用荧光方法，24h判定大肠杆菌的准确度为83-95%，48h后判定准确度为96-100%。进一步证实实验，接种一环假定阳性试管的培养物到L-EMB培养基上，35培养24±2h，接着往下的操作方法与前面部分I相同。.瓶装水大肠菌群和大肠杆菌检测方法瓶装水的消耗量在全球范围内迅速升高，仅在美国，1988年就消耗了36亿加仑的瓶装水(国际瓶装水协会，Alexandria，VA)不象常用水，是由美

20、国EPA监管，瓶装水在美国法律上定义为食品，是由FDA监管。FDA定义瓶装水为装在密封瓶中或其他容器中的水，不含有任何添加剂，除一些安全抗菌剂外，在限制范围内，有些被添加了氟化物。瓶装水本身就是一种饮料或作为其他饮料的一种成分。这些法规不适合于软饮料或其他相似饮料，除瓶装水或饮用水外，在FDA CFR103节也定义了不同类型的瓶装水来满足一定的标准。这些定义包括“自流井水”、“地下水”、 “矿物质水”、“纯化或纯净水”、 “苏打瓶装水”、“泉水”和“井水”。另外“无菌水”美国药品局定义为经无菌检测后合格的水.在瓶装水中，大肠菌群并不一定是致病菌，而且很少检测出，但是作为一个卫生指标或可能受到微

21、生物污染的指标，大肠菌群作为瓶装水质量控制是一个非常有用的指标。但有些国家也检测其他的微生物数量作瓶装水的质量指标。在现有瓶装水质量标准下，FDA已经建立了一套检测大肠菌群的方法，可通过膜过滤法或10管MPN法。详细的标准方法可联系Peter Feng博士、FDA、CFSAN、大学公园、MD、20740、301-436-16501. 设备和材料a. 培养箱,35±0.5b. 滤器： 玻璃的,塑料的或不锈钢的c. 紫外灭菌室,进行滤器灭菌d. 过滤管或真空瓶e. 真空源(电动真空泵或其他)f. 滤膜:无菌白色或隔栅 直径47mm,孔径0.45umg. 平皿:无菌 塑料的 大小50*12

22、mm 带盖h. 无齿镊子2. 培养基a. LST肉汤(M76)b. BGLB肉汤(M25)c. M-ENDO培养基或LES ENDO琼脂3. 10管近似MPN法检测和确证大肠菌群在线瓶装水的检测：取100ml样品水，从中取10ml加入2 倍浓度的LST肉汤管中，共10管。35培养24±2h，观察是否产气(含有小导管)，或轻轻摇动试管，产生气泡为阳性管。如果为阴性管，继续培养24h，观察是否产气。确证实验把产气的LST管轻轻摇匀，用直径为3.0-3.5mm的无菌接种环接种一环或几环到BGLB肉汤中，也可用木制小钩接种，插入液面下2.5cm处。把接种的BGLB肉汤放置35培养48

23、7;2h，检查产气情况。根据10管MPN表(9221.III)P.9-52(水和污水的标准检测方法)计数出大肠菌群的MPN数。4. 膜过滤法检测大肠菌群过滤样品液100ml，把膜转移到M-Endo培养基中或LES Endo培养基上，35培养22-24h低倍显微镜计数, 大肠菌群为红色菌落或暗红色菌落,并有绿色金属光泽,有时菌落中心或整个菌落显金属光泽.确证实验:滤膜上的有金属光泽的菌落在5-10之间，则分别挑取所有菌落，接种到LST肉汤中，35培养48h。滤膜上的有金属光泽的菌落10个以上时,随机选取10个菌落,分别接种到LST肉汤中,任何LST肉汤产气的培养物,再转接到BGLB肉汤中, 35

24、培养48h,任何BGLB肉汤中产气的试管,确证为大肠菌群,计数出每100ml样品液中所有大肠菌群数.注意:1998年第20版P.9-60允许同时接种到LST肉汤或BGLB肉汤中培养.由于BGLB有强抑制性,因此,此方法规定从LST产气,再转接到BGLB中培养是有更好灵敏度的.贝类和贝肉中大肠菌群检测方法.官方FDA检测国产和进口的双贝类全部参考APHA1970年第四版,<<海水和贝类的检测方法>>.此方法包括传统的5管MPN法检测大肠菌群和粪大肠菌群,和标准细菌总数计数法,本方法适用于检测双贝类、鲜无壳肉、 鲜无壳冷冻肉 和半壳中冷冻双贝类,不适合于检测螃蟹、龙虾和虾米

25、，或经预处理的双贝类肉制品,例烘烤、预炒和热处理的。许多其他方法用于检测环境水和双贝类养殖水此处不包括。美国EPA进行环境水的检测，贝类养殖水的质量控制，分别由各个州自行检测。1. 样品的制备：随机挑选10-12个贝类，从中称取200g贝肉液体或贝肉，用200ml无菌磷酸盐缓冲液或0.5%蛋白胨水进行样品12稀释均质2min。泥土中贝类样品的分析需在均质后2min内开始，用0.5%无菌的胰胨水或无菌的磷酸盐缓冲液进行系列样品稀释。2. MPN法-大肠菌群近似检测和确证取分装有乳糖肉汤（M74）或LST肉汤（M74）的试管，进行以下实验：a. 取5支试管，每管加入2ml均质液（相当于1g贝类）b

26、. 取5支试管，每管中加入2ml 110稀释液（相当于0.1g贝类 ）c. 取5支试管，每管中加入2ml 1100稀释液（相当于0.01g贝类 ）d. 取5支试管，每管中加入2ml 11000稀释液（相当于0.001g贝类）若结果不准确时，需进一步稀释。放置于35培养，余下的实验方法与1.C部分和上面的1.D相同。但结果报告时，此处是每100g样品中的MPN数，而不是1g样品中的MPN数。3、MPN法-贝肉中粪大肠菌群的近似计数和确证实验近似的检验方法同前面的第2部分。确证实验：从阳性的LST肉汤中，接种一环到EC肉汤中，置于带盖的水浴箱中，44.5±0.2培养24±2h。

27、EC肉汤中产气的管为确证的粪大肠菌群，根据前面的方法计算出MPN数。4、 MPN法EC-MUG法检测贝肉中大肠杆菌前面章节的MUG法也可用检测贝鱼肉中的大肠杆菌，但需稍做修改，由于贝鱼肉中含有天然的-葡萄糖苷酶活性，例如：牡蛎肉样品加入LST-MUG培养基会产生假阳性。因此， 贝类肉中大肠杆菌检测，加MUG到EC肉汤中，44.5培养，按传统5管进行粪大肠菌群确证实验。通过在紫外灯下可以进行大肠杆菌的MPN计数。贝类中粪大肠菌群的检测，以EC-MUG肉汤替代EC肉汤，其他的操作方法与部分3相同。检测EC-MUG肉汤中荧光，还需做3个对照，一管为大肠杆菌阳性菌，一管为肺炎克雷伯氏菌作荧光阴性对照，一管为空白对照，水浴培养。 待检测样品、阳性对照同时置44.5±0.2培养24h，按上面LST-MUG法检测荧光。注意有些大肠杆菌不产气，但荧光阳性。计数