基因工程大题

1、2基因工程操作的基本步骤是什么？ 施工材料的准备，即目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿 主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。（切） 目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分 子。（接） 把重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性 繁殖系。（转和扩筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基 因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。（检）3如何理解基因工程的两个特点？答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表 达。分子水平的操作包括 DNA分离、切割和连接（还有其他一些 DNA的修饰等）。由于体外重组 DNA的最终目的是要改变生物的 遗传性，所以分子水平的操作

2、和细胞水平的表达是基因工程的两 个最基本的特点。4基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的？答：大分子质量的DNA会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制 位点，因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生 许多不同的DNA片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因 或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体 分子混合时（如图所示），每个片段将插入一个不同的载体分子（如 一个质粒）。同样地，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细 胞将只接收一个质粒 DNA分子，而筛选出的含重组质粒的每个菌 落实际上会含有某一特异的供体 DNA片段的多个拷贝。一旦带有 待研究的特定基因

3、的克隆被确认了，此重组DNA分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。5比较遗传工程、基因工程和生物技术。答：遗传工程是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工 程技术上的设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染 色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作，以求定向地改造生物 的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。狭义的遗传工程 就是指基因工程。基因工程（gene engineering ）又称基因操作（gene manipulation ）、重组 DNA（ recombinant DNA ）。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代 方法手段，将不同来源的基因（DNA

4、分子），按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的 遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功 能。生物技术又称生物工艺学，生物工程学。是根据生物学、化 学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细 胞及其亚细胞组分，进而利用生物体所具有的功能元件（如基因、蛋白质）等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。它包括 基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等。6说明Sanger DNA测序法的原理。答：Sanger DNA测序法建立在两个基本原理之上：核酸是依赖 于模板在聚合酶的作用下由5'端向3'端聚合；可延伸的引物

5、必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用四种双脱氧 核苷酸终止反应，则会获得四组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。11当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施？为什么？答：注意星号活性；先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并 且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易 产生星号活性，或使用通用缓冲液。12.何谓限制性物理图谱？答：限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图（restrictionmapping）。简单地说就是DNA分子中限

6、制性内切核酸酶切割位点 的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的 线性排列图。标明限制酶在 DNA分子上的限制性位点的数目、限 制性片段大小及其线性排列的顺序。13什么是细菌的限制一修饰系统（RestrictionModificationsystem ， R-M system）?答：细菌中有作用于同一 DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和 改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种 酶作用于同一 DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限 制与修饰系统。14细菌的限制一修饰系统有什么意义？答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制

7、与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。而外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并 将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为 细胞提供了保护。15说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 答：基本原则：属名+ 种名+株名十序号。首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写。第二个字母：取 种名的第一个字母，斜体小写。第三个字母：取种名的第二个字 母，斜体小写。第四个字母：若有株名，株名则作为第四个字母， 用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制

8、酶，则按先 后顺序冠以I、II、山 等，用正体。所有的限制酶，前面还应 带有系统的名称，如限制性核酸内切酶 R. Hi nd III 。修饰酶则在 前面加上甲基转移酶 M如甲基转移酶M. Hi nd III 。在上下文已 清楚只涉及限制酶的地方，R可被省去。16何谓限制性内切核酸酶的切割频率？答：切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均一的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那 么对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为1/4n，n表示该限制酶识别的碱基数。如识别 4个碱基的限制酶，其切割频率应 为每256

9、个碱基有一个识别序列和切点（1/44 = 1 / 256），识 别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一个识别序列和切点，余类推。18双酶消化法（double digest ）绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理是什么？答：双酶消化法是绘制DNA中两个或两个以上限制性内切核酸酶 图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消 化DNA分子的基础上，再用这两个酶同时或先后消化DNA根据它 们的结果构建物理图谱。17什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素的影响？答：II类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种 特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表

10、现出来的特异 性。条件发生改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切 割都有一些改变。改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条 件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第 二活性又称为星号活性。诱发星号活性的因素有如下几种：高 甘油含量（5%，v/v）:限制性内切核酸酶用量过高（ 100U/ gDNA）;低离子强度（v 25mmol/ L）;高pH（8. 0以上）： 含有有机溶剂，如DMSO乙醇等；有非Mg2+的二价阳离子存在（如 Mn2+ Cu2+ Co2+ Zn2+等）。19什么是 DNA 多态性（DNA polymorphism）?答：在正常人群中，各个体 DNA分子的某

11、些位点可以发生中性改 变，这些改变虽然会使 DNA一级结构产生一定变化，但不影响基 因的表达，如果这种中性突变在人群中的频率不低于1 %，这一现象被称为多态性。DNA多态性本质上是染色体 DNA中核苷酸数目 或排列顺序的个体差异，这些差异多数为中性突变，不引起表型 改变。20什么是限制性片段长度多态性（restriction fragmentlengthpolymorphism ， RFLP）?答：当DNA序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时， 或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的 改变可以经凝胶电泳区分时，DNA多态性就可应用限制性内

12、切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性（RFLP）。22何为回文序列？答：回文序列（palindromic sequence ）是一段自我互补的序列， 即同其互补链一样的序列（两者的阅读方向都是从53,）。根据回文序列的结构可分为：完全的回文序列、不完全的回文序列 和间断的回文序列。完全回文序列（如 GAATTC，通常是限制性 内切核酸酶的识别序列； 不完全的回文序（TACCTCCAT,CGTGATA 常是其他蛋白质的结合位点（如阻抑蛋白），在基因表达调控中有 重要作用；间断的回文序列（如 GGTTXXXAAC（有 一段是颠倒的重 复），它可使单链的核苷酸有可能在tRNA中所见到

13、的一样，形成发夹环的结构。23DNA连接酶的连接机理是什么？答：DNA连接酶是利用ATP或NAD+烟酰胺腺嘌吟二核苷酸（氧化 型）提供的能量催化DNA双链间的缺口形成磷酸二酯键。在连接 反应中，首先ATP （NAD+）与DNA连接酶反应，同连接酶生成一种 共价结合的酶-AMP复合物。其中AMP腺苷一磷酸）通过一种磷酸 酰胺键同DNA连接酶的赖氨酸残基的£ -氨基相连。同时释放出焦 磷酸或烟酰胺单核苷酸（NMN。AMP激活DNA 一条链的5'-末端 磷酸基团，并转移到磷酸基团上，形成 DNA腺苷一磷酸复合物。 最后，3' -OH对激活的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，

14、同 时释放出AMP连接反应是由在形成酶-腺苷酸复合体时，焦磷酸 水解和释放提供的能量驱动下进行的。在以ATP作为能源的连接酶中，一个磷酸二酯键的形成消耗掉两个高能磷酸键。29列举质粒载体必须具有的基本条件。答：（1）能独立复制；（2）具有选择标记；（3）有独特的酶切位点；（4）能转化但不扩散。24DNA连接酶的作用特点有哪些？连接反应需要在一条DNA链的3 '末端具有一个游离的-0H,而 另一条DNA链的5'末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，才能 发挥其连接DNA分子的功能作用，而在末端带有 5'-羟基和3'- 羟基；5'-磷酸和3'-二脱氧

15、核苷基团的两个DNA片段之间不起 连接作用。 连接反应中需要 ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子 和激活因子； DNA连接酶不能够连接两条单链的 DNA分子，被 连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。 DNA连接酶只封闭双螺 旋DNA骨架上的缺口 （Nick），即在双链DNA的某一条链上两个相 邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封 闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口 25影响DNA连接酶连接反应的因素主要有哪些？答：1）反应温度：最佳反应温度37 °C，但黏性末端之间退火形成 的氢键结合不稳定，连接黏性末端的最佳温度，一般认为4 20 C比较

16、合适。2） DNA片段末端：不仅要考虑反应体系中 DNA末端的 总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应 保证一个DNA分子的末端有较高的几率与另一DNA分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段3 : 11 : 3。3）连接酶浓度：平末端DNA分子的连接反应，最适酶量大 约是12单位；而黏末端DNA片段间的连接，在同样的条件下， 仅为0.1单位时，便能得到最佳连接效率。28切口平移法制备DNA探针的原理是什么？ 答：在Mg离子存在时，用低浓度的 DNA酶I （DNase I ）处理双链 DNA使之随机产生单链断裂。然后用 DNA聚合酶I的5' t

17、3'外 切酶活性可以从断裂处的 5'端除去一个核苷酸，而其聚合酶活 性则将一个单核苷酸添加到断裂处的3'端。随着反应的进行，即5'端核苷酸不断去除，而 3'端核苷酸同时掺入，导致断裂形 成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象称为切口平移。如果在反应体系中加入放射性同位素标记的核苷酸，则这些标记 的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，用作DNA分子杂交探针。27碱性磷酸酯酶主要有两种，细菌碱性磷酸酯酶（BIP ）和小牛肠碱性磷酸酯酶（CIP），二者有什么不同？在基因工程中有什么用 途？答：主要差别是CIP在68C时失活，而BAP在

18、68C稳定，且耐酚 抽提。应用：dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但 是用CIP处理后，最好将CIP除去，再进行连接反应。 DNA和 RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。30举例说明什么是穿梭载体？答：穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标 记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主（来回穿梭）。38.质粒制备的基本原理？答：带有质粒的细菌细胞在 SDS作用下裂解，并在碱性条件下使 DNA变性。调节pH值至中性时，质粒DNA首先复性，而细菌基因组 DNA不能复性而与SDS蛋白质 形成复合体，可

19、以被离心沉淀除去。上清液中的质粒 DNA分子可 被酒精沉淀或其他方法沉淀纯化出来。26什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA聚合 酶I ,得到的两个片段。其中大片段的分子质量为75kDa,它具有5' -3'聚合酶和3' -5 '外切核酸酶的活性，小片段具有 5 3' 外切核酸酶活性。由于大片段失去了 DNA聚合酶I中会降解5'引 物的5'- 3'外切核酸酶活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：（1）修复反应，制备平末端。

20、可用 Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的 脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'端标记的探针。用Klenow酶修复5 '突出端的反应主要是利用了 Klenow酶的DNA 聚合酶活性，是填补反应；而修复3'突出端则是用Klenow酶的3' -5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出端是不理想的，改用 T4 DNA聚合酶或其他的酶是更 好的选择。（2）标

21、记DNA 3突出端（protruding end） 。该反应 分两步进行：先用3' - 5'的外切核酸酶活性除去3'突出端， 产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物 （32P-dNTP）存在下， 使降解3' -5'）作用与聚合（5 ' - 3'）作用达到平衡。这种 反应也叫交换或取代反应 （exchange /replacement reaction） 。 不过这一反应用T4 DNA聚合酶的效果更好，因它的 3' -5'的 外切核酸酶活性较强。（3）其他的一些用途。包括用双脱氧末端终 止法进行DNA序列分析、用于

22、cDNA第二链的合成、在定点突变中 用于合成第二链、用引物延伸法（primer extension）制备单链DNA探针等。31YAC载体具有什么样的？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？答：（1）功能性DNA序列：来自于酵母的125bp DNA片段的着 丝点序列（CEN4）。来自酵母的自主复制序列 （ARS1），起始在 酵母中的DNA复制。来自酵母的端粒序列，它是 （5-TGTGGGTGTGGTG-3勺多拷贝重复，它对染色体的复制和维持 是必需的。在酵母中进行选择的标记基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是这些基因的营养 缺陷性，只有带有这些基因的转化体才

23、能在选择培养基上生活具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC载体通常含有ColE1的ori和氨苄青霉素抗性标记基因，可以在大肠杆菌中复 制和繁殖，所以它也是一种穿梭载体。（2）优越性：YAC能够容纳长达上千kb的外源DNA这是质粒和 黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色 体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文 库所需的克隆数目。40为什么野生型的 入噬菌体DNA不宜作为基因工程载体 ？答：（1）噬菌体DNA没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的，不能大于基因组的105%，所以要将入噬菌体改造成载体，必须削减本身的 分子大小；（2）野生型

24、的入DNA对于一些常用的酶都有多个识别 和切割位点，不便于克隆；（3）没有可供选择的标记；（4）野生型的入噬菌体具有感染性，因此不够安全。33什么是YAC? YAC克隆载体常出现哪些问题？答：YAC 即酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome ）的 缩写，是人工构建的染色体样大容量克隆载体，基本组成有着丝点、能在细菌和酵母中进行复制的 复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA克隆片段可达到2000kb。问题有：（1） YAC有嵌合现象，一个YAC中克隆的DNA片段可能 来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆 总数的10%60%。（2） YAC内部有

25、重组现象，插入的 DNA较大, 序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，重组很难检出。YAC还有缺失现象，影响 YAC文库的代表性。（4） YAC结构 和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC和酵母天然染色体分开。（5）构建好的YAC转化原生质化的酵母菌，转化 效率低。（6）建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大 32由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操 作基因的安全。进行严格地监控对质粒载体的安全是十分重要的。 请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面？答：（1）非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说， 都不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动

26、转移。（2）具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307 （ColE1的衍生质粒）在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散， 只存在于限定的宿主细胞中。（3） 般情况下不希望与宿主染色 体发生重组，因为重组后有可能给宿主带来突变。（4）有较小的宿主范围。34什么是BAC？ BAC载体的组成与优缺点有哪些？细菌人工染色体（BAC是从大肠杆菌F因子改造构建而来的， 能够携带大约300kb的DNA插入片段。载体具有F因子的复 制起始点（oriS ），可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。 载体包括有4个维持DNA复制和拷贝数目的基因，repE, parA, parB and parC。具

27、有一个抗生素选择标记基因，和lacZ '基因。在lacZ '基因中组装有一多克隆位点，便于外源片段的插入 和蓝白反应筛选克隆子。插入的DNA片段非常稳定，可以在大肠杆菌细胞中维持数百代，而且不易发生重组和从寄主细胞中 丢失。 主要缺点是每个细胞中的拷贝数少（12个），使得分 离和筛选较为困难。35利用pBR322质粒插入失活分离带有外源 DNA片段的重组克隆 的原理是什么？ 外源DNA片段插入在pBR322质粒tetr基因的编码序列内（BanHI）位点，使该基因失活； 体外重组反应混合物转化大肠杆菌 ampstets菌株，并涂布在amp琼脂平板上，凡获得了 pBR322质粒和重

28、组质粒（AmprTets）的 寄主细胞都可长成菌落； 将amp琼脂上的菌落原位影印在tet 琼脂平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情况，凡在amp平板上能够生长而在tet平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样的阳性克隆，扩增分离带有外源 DNA插入片段的重组体质粒。46分离DNA时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA和蔗糖？答：EDTA是螯合剂，可同Mg2+螯合，使核酸酶失去了作用的辅助因子，而被抑制活性。蔗糖增加缓冲液的黏度，保护 DNA不易断裂。36pUC质粒利用a -互补作用筛选重组子原理是什么？答：pUC系列质粒载体是在pBR322质粒载体基础上改造

29、来的，它 用lacZ '基因取代了 PBR322质粒载体上的tetr基因。lacZ '基 因编码B -半乳糖苷酶的N末端1-63个氨基酸（a -肽链）的DNA 片段，在lacZ '基因内组入了一个多克隆位点（ MCS，但不影 响lacZ '基因的功能。pUC载体的宿主（E. coli ）携带一个编 码B -半乳糖苷酶C端序列的基因片段，它们本身用这个基因片 段产生的B -半乳糖苷酶片段是无活性的，但它们可以通过a -互 补作用在体内相互弥补，即两部分产物可以结合形成有活性的B-半乳糖苷酶。当pUC质粒引入大肠杆菌中，在含有指示剂X-gal和IPTG的诱导培养基上

30、培养时，菌落成蓝色。如果在MCS插入外源DNA片段（基因），破坏了 lacZ '基因的功能（插入失活）， 不再产生a-肽链，不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的 B -半乳糖苷酶，形成的菌落是无（白）色的。因此，根据这种 B - 半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。37自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是 ColE1和 PSCIO1这两个自然质粒也不尽如人意，通常需要进行改造。请问 质粒改造包括哪些基本内容 ？答：基本内容包括：（1）删除一些非必要的区段及对宿主有不良 影响的区段；削减载体的分子质量，使载体具有更大的容纳外源 片段的能力。

31、（2）加上易于选择或检测的标记。（3）限制性内切 核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位 置。（4）加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。（5）安全性改造，限定载体的宿主范围。42入噬菌体载体具有哪些优点与不足 ？答：优点： 入基因组中有1/3的非必需区可以被置换。改造 成载体后，克隆的片段较大（可达20kb），而质粒载体的克隆片段 只有几个kb; （2）用噬菌体入DNA作为载体，即使不进行体外包 装，转染的频率也比质粒转化的效率高，包装后的效率就更高了；（3）入可通过溶原化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基 因大量表达时，可让 它以溶原性存在，若要表达，可通过诱导即

32、可进入裂解途径，释放出大量的噬菌体，得到的重组DNA的拷贝数就会很多。缺点：（1）包装比较麻烦，包装率不稳定，购买包 装蛋白的费用高；（2）没有质粒的用途广泛。43以置换型入噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬 菌斑的就一定是重组体 ？答：改造的置换型噬菌体载体，重组入外源片段之后，总体积不 能超过入基因组的105%，不能小于又基因组的75%。以置换型入 噬菌体DNA作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA重组。如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于久基因组的75%，不能被包入噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，总长度超过入基因组105%后，也不能

33、包入噬菌体颗粒，自然也不能形成噬菌斑。47分离DNA用酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是停留 在水相和酚相之间？答：酚使蛋白质分子间脱水而变性，变性蛋白的密度比水大，但 比酚小，因此停留在中间层。44M13系列载体具有哪些优缺点 ？答：M13克隆系统具有很多优点：（1）克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制， 所以容载能力大。有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝 状噬菌体DNA长67倍的DNA（插入片段可达40kb）。（2）可直接 产生单链DNA这对于DNA测序、DNA诱变、制备特异的单链 DNA 探针都是十分有用的。（3）单链DNA和双链DNA都可以转染宿主， 并

34、可根据人工加上的选择标记进行筛选。M13克隆系列的不足：（1）较大的外源片段插入后，在扩增过程 中往往不够稳定。一般说，克隆的片段越大，发生丢失的概率越 大。（2）单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂， 分离双链比较麻烦。45黏粒载体具有哪些特点与不足 ？答：主要特点有： 柯斯质粒是含有 入噬菌体COS位点的质粒 载体。柯斯质粒具有质粒的复制子，进入寄主细胞后能够像质粒 一样进行复制，并且能够被氯霉素扩增。具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记和克隆位点。插入片段的消化、连接及后来重组克隆的纯化与质粒载体相同。具有入噬菌体的包装和转导特性。与质粒载体转化细菌细胞不同，重组体像入载体一

35、样， 需体外包装后转染细菌。包装后形成的入颗粒用来感染大肠杆菌，重组DNA像入DNA 一样注入细菌细胞，并以 CO位点环化。 由于缺乏入的其他DNA序列，环化DNA在细菌体内以质粒一样维 持。 简化了筛选。载体体积小，承载外源DNA片段大。如果载体的分子质量在5kb的话，得到的转导子几乎排除由载体自连 的可能性，因为要被成功包装，至少要7个分子的载体自连。尽管如此，也是不能被包装的，因为 COS位点太多了。重组体只有 达到32-45kb才能有效包装体外包装，这就提供了对重组体的正 向选择。 对转化体的选择是基于载体上的抗生素标记。感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒载体也有如下不足：如果两个黏粒

36、之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或丢失。 含不同重组DNA片段的菌落生长速度不同，会造成同一个平 板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量的 比例失调。 包装过程复杂，包装效率不稳定，代价高。39入噬菌体DNA被包装到噬菌体的头部需要哪些基本条件？为什 么？答：两个cos位点；线性DNA分子大小在 入噬菌体基 因组的75% 105%。48为什么从细胞中分离 DNA时往往会断裂？答：（1）胞内存在很高的核酸酶活性，DNA裸露后，很容易遭到 核酸酶的降解。（2）在分离DNA的过程中，要用到一些酸碱等化 学试剂，也会使DNA断裂。（3

37、）在DNA的分离过程中要经过多次 离心、吸取、转移等，产生的机械张力剪切会使 DNA断裂。49在DNA分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用 也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么 ？ 答：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA最终不能除去酚，残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切 核酸酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白质变性剂，它不与水互溶， 但是能够同苯酚互溶。这样，酚和氯仿联合使用，就可以带走残 留的酚。50何谓简并引物（degenerate primer）?答：所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列（或部分序列），并充分考虑密码子的简并性而设计的、用于PCR扩增的

38、混合引物群体，这种混合引物之间具有不同的碱 基组成，但碱基的数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性， 在这种混合引物中必定有一种引物是可以和该基因的DNA序列精确互补。51简并引物设计的一般原则是什么？答：（1）选择保守区设计简并引物。（2）选择简并性低的氨基酸 密码区设计引物。（3）注意密码的偏爱性。（4）使用尽可能短的 引物，以降低简并性，最短可用1520个碱基。（5）由于TaqDNA 聚合酶在PCR扩增时容易掺入错误碱基，所以设计的引物，其3'端尽量使用具有简并密码的氨基酸。52如何用PCR制备突变DNA分子？答：可用PCR进行定点突变（Site Directed Mutage

39、nesis） ，即在特定位点引入点突变。该突变可以是碱基替代、插入或者缺失。 为了在靶基因特定位点导入突变，在PCR引物设计时，将一条引物设计成与靶序列互补但在预期位点作碱基替换或缺失。在引物 中的诱发突变序列应该位于引物的5'端或在引物中间部位，但绝不能位于3'端。诱变引物的3 '区域（至少610个碱基）必须与 靶DNA完全互补以使引物与模板的退火完全而且Taq酶能延伸引物。PCR反应先在低特异性环境下反应 510个循环以使错配得 以发生（即在松弛的温度下），一旦少量的突变模板产生，就可以 作为靶序列与引物完全互补。扩增反应的终产物即是所需的含有 突变的扩增DNA分子

40、，然后通过克隆和序列分析进行确证。53用PCR技术扩增目的DNA片段时，需要一对特意合成的引物来 限定目的片段的扩增区域，试说明引物序列合成应遵循什么样原 则。答：1）引物长度一般为1530个核苷酸。2）引物的碱基尽可能 随机，G+C 含量一般占 45%55%。Tm= 4（G+C）+ 2（A+T）3）引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。4） 两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3 '端的互补重叠。5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70%，引物3'末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易 导致非特异性扩增。6）引物3'端碱基是引发延伸

41、的起点，因此 一定要与模板DNA配对。7）引物与模板结合时，引物的 5'端最 多可以游离十几个碱基而不影响 PCR反应的进行。8）引物的5' 端可以修饰，如附加限制酶位点，弓I入突变位点等。56怎样将一个平末端的DNA片段插入到EC讯I的限制位点中去？ 答：可以化学合成一个连接子（linker ），即一段长为lObp含有 EcOR I识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起 来，如果用EcOR I切割这种连接片段，就会产生 EcoR I的单链 末端。这种片段就可以插入到任何EccR I的限制性核酸内切酶位55TaqMan定量PCR扩增的原理是什么？答：TaqMan定

42、量PCR使用3个引物，或两个引物和一个特异性 探针。两个引物接合到目的 DN上下游，以进行目的DNA的合成。 第三个引物，或称探针，是特异合成的一段短的DNA片段，可特异性第接合到一条DNA链中间。探针带有两个修饰基团，5'端荧光报告基团（R）和3'端的荧光淬灭基团（Q，这两个基团由于 距离靠近会发生荧光淬灭而检测不到荧光。随着PCR的进行，TaqMar探针接合到目的DNA序列上，并且被具有外切酶活性的 Taq DNA酶逐个切除而降解。被切下来的荧光基团（R）解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发岀荧光，因此所产生的荧光强度直接 反应了扩增靶DNA的总量。54PCR技术体外扩增D

43、NA分子的基本原理是什么？ 答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞 内DNA半保留复制的机理，以及体外 DNA分子于不同温度下双链 和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度， 以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然 后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双 链DNA PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需 要重复进行DNA模板解链、引物与模板 DNA结合、DNA聚合酶催 化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤 构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。

44、DNA模板变性：模板双链DNA单旌DNA 94'C。 退火：引物+单链DNA杂交幫 引旳忙Tm值。引物的延伸：温 度至70 C左右，Taq DNA聚合酶以4种dNTP为原料，以目的DNA 为模板，催化以引物3'末端为起点的5't3' DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一 轮循环反应的模板PCR就是如此反复循环，使目的 DNA得到高效 快速扩增。57构建基因组文库时为什么要对基因组 DNA进行部分酶切？（列 举至少两条理由）答：部分酶切可获得长度适宜的片段（如获得中等长度的酶切 片段）；部分酶切可保证切出的DNA片段内部依然

45、保留了部分限制酶位点，便于后续的克隆分析。58什么是基因组文库（genomic library） ?它同遗传学上的基因库 有什么不同？答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物 基因组DNA的各种片段的克隆群。包括下列过程：高分子质量染 色体DNA的制备；体外重组连接；将重组 DNA导入寄主细胞并扩 增；筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概 念。基因库（gene poo1）是指在进行有性生殖的某一群体中，能进 行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于 使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、 YAC文库、BAC文库等。61如何使用

46、甲基化酶对克隆 DNA进行保护？有什么意义？ 答：在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的 甲基化酶对克隆DNA先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能 的识别序列先行保护起来。意义：用这种方法，不仅保护了插入 片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段 中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用 特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。59什么是cDNA文库？同基因组文库有何差别 ？答：同mRNA互补的DNA称为cDNA cDNA文库是以某一生物的总 mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成 一互补的DNA即第一链，破坏RNA模板后，再

47、以第一链为模板合 成第二链，得到的双链 DNA称为cDNA选用适合的载体，将合成 的cDNA重组导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克 隆真核生物基因的一种通用方法。由于细胞内的基因在表达的时 间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特 殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建得十分完全的，也 就是说，任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物的全部编码基 因。cDNA文库与基因组文库的主要差别是：（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的 DNA序列；cDNA文库克隆的是具 有蛋白质产物的结构基因

48、，包括调节基因。（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响。 （3）基因组文 库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；而cDNA克隆的是不含内含子的基因。62何为稀有酶？（举例说明） 答：所谓稀有酶是指那些识别序列在基因组DNA中不常见的酶，因此它们的切割频率较低。如 Not I就是最常用的稀有酶，它的 识别序列为GCJ GGCCGC另外有些酶的识别序列虽然不长，但它 的识别序列很特别，在基因组出现的频率较低。女口Nru I （TCGCGA）和BsSH II （GCGCGC），它们的靶序列在哺乳动物基因组中出

49、现的 频率极低。60什么是同聚物加尾连接法 （Homopolymer Tails Joining） ? 用 何种方法加尾？具有哪些优缺点？答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA（ dQ和dT（ dC），然后在DNA连接酶的作用下，连接成为重组的DNA这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+乍为辅助因子，该酶可以在突出的 3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用 Co2+乍辅助因子，则

50、可在隐 蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。同聚物加尾法实 际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：首先不易自 身环化，这是因为同一种 DNA两端添加的序列是相同的，所以不 存在自身环化；因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端， 所以连接效率较高；用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：方法繁琐； 外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的序列，可能会影 响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接 后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。，68插入失活法和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么？ 答：

51、主要差别是：（1）插入失活法是直接根据失活基因的表型变 化来筛选重组体。（2）插入表达法是根据一个基因的失活引起另 一个基因的表达表型来选择。66构建表达载体应注意些什么？答：（1）构建表达载体的关键是用于表达克隆序列的启动子类型， 如果目的是基因的高效表达，就要选用强的启动子；如果表达产 物对寄主细胞有毒性，可选择弱的启动子，最好使用可诱导型启 动子，使在一定的条件下表达。（2）表达载体还应具有以下组成元 件：携带能在寄主细胞中维持的复制的起始点。具有抗生素选择标记或其他选择机制。在紧接启动子的下游安排限制性位点，用于插入需表达的基因。具有单一的酶切位点来克隆基因，克隆位点应位于准确的位置，

52、以使克隆基因有效表达。67你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根 据方案，下面一个步骤是用 NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单 链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是 空白。错在哪里？提示：转移到膜上的DNA未变性成单链DNA不能与单链的探针杂 交。如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加入杂交混合物之 前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。69个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基 因中有识别位点的EcoR I消化。消化物与酵母DNA连接后转化对 两种抗生素都敏感的E.

53、coli菌株。（1）利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞？怎样区分接受了插入酵母 DNA的质粒的克隆？提示： 选择Ampr的转化子；所需的克隆是Ampr和Kans。任何能够抗这两种药物的克隆都 是自连的非重组质粒。70用EcoR I和Hind III 分别切割同一来源的染色体 DNA并进行克隆。在前者的克隆中筛选到 A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。提示：因为HindH I的切点位于A基因内。71什么是 Western印迹？它与Southern 印迹有什么不同？提示：Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固 相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与So

54、uthern印迹的不同在于探针的性质不同，在 Western印迹中使用的探针是抗体（蛋白质），而Southern印迹中使用的探针是 DNA72用一限制性内切核酸酶切割 Lac+ Tetr 的质粒载体，已知该酶 识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该 酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位 点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用 DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环， 转化Lac- Tet-受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是 什么？并说明原因。提示：基因型是lac ,原因是在该密码子中插入了两个碱基，造

55、成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的。严谨杂交实验是如何控制的？答：杂交反应的严谨程度由下面两个因素所决定：温度和盐浓度。 强的碱基对能耐受高的温度，而高的盐浓度使弱的碱基对间的配 对变得稳定。因此，高度严谨的杂交在高温和低盐浓度下进行， 而低严谨型杂交在低温和高盐浓度下进行。73RNA与基因组DNA复性已被广泛用于检测不同类 DNA的转录。DNA驱动的复性实验与RNA驱动的复性实验有何不同？ 答：在过量DNA杂交（DNA驱动杂交）实验中，基因组DNA的复性 过程中加入少量的放射性标记 RNA因为DNA的量大大超过RNA 所以全部RNA能够与DNA杂交。同样道理，RNA驱动的杂交反应 中RN

56、A过量而DNA的量受到限制，所以所有的互补 DNA链都能与 RNA杂交。74在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加 上细菌的启动子？答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子的原因。75如何根据下面的应用设计探针？（1）假定你分离纯化了一未知功能的蛋白质，需要确定是何种组织和细胞表达这种蛋白质。（2）假定你获得了绵羊的胰岛素 mRNA如何进一步从人的cDNA文库中 获得含人胰岛素的克隆并使之在 E. coli中表达？提示：（1）首先对该蛋白质进行部分测序，然后根据测得的氨基 酸序列设计简并引物

57、。（2）以该mRNA为模板反转录，得到cDNA即可进行标记用作探针。 76什么是遗传学选择法？答：所谓遗传学选择法（genetic selection ）主要是根据受体细 胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型的变化直接选择重组 体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表 型及噬菌斑的变化等。选择的方法主要是根据平板上可见的表型 变化，用于选择的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平 板、插入表达抗生素平板、显色平板等，由于这些方法都是直接 从平板上筛选，所以又称为平板筛选法。77单链RNA作为探针，具有哪些单链 DNA探针所没有的优点？答：单链RNA探针的下列优点是单链 D

58、NA探针所没有的：（1） RNA / RNA和RNA/ DNA比DNA/ DNA杂交体具有更高的稳定性。因此， 杂交可以在更严格的各件下讲行杂交后的信号也比较强。（2）单链RNA由于不存在互补双链的竞争性结合，所以杂交效率 比较高。3） RNA中不存在重复序列，所以特异性比较高。杂交后可用RNase消化掉未杂交的RNA因此降低了本底。78良好的固相支持物（如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜）必须具备哪 些优良特性？答：（1）同核酸分子具有较强的结合能力，一般要求每平方厘米 结合核酸分子的量在10卩g以上。（2）与核酸分子结合后，不影 响其同探针分子杂交的反应。（3）与核酸分子的结合牢固，能经受得住杂交、洗涤等过程而极少脱落。（4）非特异性吸附少，在洗膜条件下，能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱。（5）具有良好的机械性能，不宜破碎。16. 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。（1）COS位点可以自身环化可以利用COS