玉米籽粒穗轴花色苷含量两个显性基因的上位性研究与叶脉叶耳颜色的进一步定位毕业论文

1、单位代码 10635 学 号 0784硕硕士士学学位位论论文文玉米籽粒、穗轴花色苷含量两个显性基因的玉米籽粒、穗轴花色苷含量两个显性基因的上位性研究与玉米叶脉叶耳颜色的进一步定上位性研究与玉米叶脉叶耳颜色的进一步定位位论文 袁文娟指导教师： 蔡一林 教授学科专业： 生物化学与分子生物学研究方向： 玉米分子育种提交论文日期：2013 年 4 月 10 日论文答辩日期：2013 年 6 月 1 日学位授予单位：西南大学中 国 重 庆i / 552013 年 6 月独独创创性性声声明明学位论文题目玉米籽粒、穗轴花色苷含量两个显性基因上位性研究与玉米叶脉叶耳颜色的进一步定位 本人提交的学位论文是在导师

2、指导下进行的研究工作与取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究与学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、在文中作了明确说明并表示衷心感。学位论文 签字日期： 年 月 日学学位位论论文文使使用用授授权权书书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：不，期限至 年 月止） 。学位论文作者签

3、名： 导师签名：签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日i / 55目 录摘要摘要 I IABSTRACTABSTRACTIIIIII第一章第一章 文献综述文献综述 1 11.1 数量性状的相关概念 11.2 QTL 定位的原理与方法 21.2.1 定位的原理 21.2.2 定位的方法 213 QTL 定位方法的最新进展 41.3.1 QTL 动态定位 41.3.2 eQTL 定位 41.33 种质资源新基因发掘的 QTL 定位方法 41.3.4 QTL 精细定位 51.4 花色苷研究进展 51.4.1 花色苷研究现状 51.4.2 花色苷结构和代途径 61.4.3 花色苷生理功能 71

4、.5 关于上位性方面的研究进展 81.6 玉米叶片相关性状定位方面的研究进展 9第二章第二章 引言引言 11112.1 研究的目的与意义 112.2 技术路线 12第三章第三章 玉米籽粒花色苷含量两个显性基因玉米籽粒花色苷含量两个显性基因 GE6GE6 和和 GE10GE10 的上位性研究的上位性研究 13133.1 材料与方法 133.1.1 试验材料 133.1.2 试验方法 133.2 结果与分析 173.2.1 遗传连锁图谱的构建 173.2.2 QTL 定位 183.2.3 MuS 与 MoS 两个群体的表型分析 203.2.4 MuS 与 MoS 两个群体的籽粒和穗轴花色苷含量的方

5、差分析 213.2.5 MuS 与 MoS 两个群体的 9 种基因型花色苷平均值的多重比较 223.2.6 MuS 与 MoS 两个群体的 GE6 和 GE10 的上位性效应分析 243.3 结论与讨论 253.3.1.对两个群体 MuS-BC4F3、MoS-BC4F3籽粒和穗轴花色苷含量定位结果分析 253.3.2 讨论 25第四章第四章 玉米叶脉叶耳颜色的进一步定位玉米叶脉叶耳颜色的进一步定位 27274.1 材料与方法 274.1.1 材料 27i / 554.1.2 田间试验 274.1.3 表型测定 274.1.4 基因型的测定 284.1.5 背景恢复率的计算 284.1.6 引物

6、的设计 284.1.7 连锁图谱的构建 284.1.8 QTL 定位方法与效应分析 284.2 结果与分析 294.2.1 叶脉、叶耳近等基因系的构建 294.2.2 BC4F3分离群体的表型鉴定 294.2.3 叶脉叶耳颜色相关的 SSR 引物筛选与新引物的设计 304.2.4 MuS-BC4F3目标 QTL 区段连锁图谱构建 324.2.5 叶脉叶耳颜色定位结果的分析 334.3 结论与讨论 334.4 主要创新点 34参考文献参考文献 3535致致 4343玉米籽粒、穗轴花色苷含量两个显性基因的上位性研究与叶脉叶耳颜色的进一步定位摘摘 要要玉米是世界上种植面积最大的作物之一，黑玉米有高的

7、花色苷含量，是很好的保健品，对人们的身体健康有重要的作用，黑玉米的主要成分是花色苷，花色苷是构成植物花瓣、叶片、果实、种子等器官颜色的最主要水溶性色素，是由苷元与葡萄糖以糖苷键形式结合形成的一类广泛存在于植物体的类黄酮多酚化合物。花色苷有多种保健功能，花色苷最主要的功能是可以清除自由基，具有抗氧化抗衰老的功能。到目前为止关于玉米上位性方面的研究多为玉米株高、穗位高、单株总叶数、穗位叶长、穗位叶宽和穗位叶面积之间的上位性研究，还有在玉米出子率进行上位性效应分析，而对玉米花色苷的上位性研究很少。上位性的研究可以丰富花色苷的遗传基础,为遗传改良提供依据。叶片是植物的重要组成部分，叶脉叶耳是叶片的重要

8、组成部分，对叶片相关颜色基因的进一步定位，为玉米中色素相关基础研究提供参考，为玉米中色素的分子标记辅助育种与玉米色素相关基因的克隆与转化提供了依据。本文利用西南大学玉米研究所新育种的材料黑玉米自交系SDM，以SDM为父本，以木6，Mo17分别为母本，构建两个回交群体，通过前景选择和背景选择获得两个近等基因系BC4F3，对控制玉米籽粒和穗轴的花色苷含量两个主效基因进行上位性研究。另外选择以SDM为父本，木6为母本，通过前景选择和背景选择获得一个遗传背景一致的近等基因系BC4F3，进行叶脉叶耳颜色的进一步定位，具体研究结果如下：1.对两个群体MuS-BC4F3、MoS-BC4F3籽粒和穗轴花色苷含

9、量两个显性基因的上位性研究 两个群体 MuS-BC4F3、MoS-BC4F3的籽粒花色苷含量在第 6 染色体上都定位到引物 S8 附近，第 10 染色体上都定位到 IDP8526-bnlg1028 附近。两群体的穗轴花色苷含量第 6 染色体都定位到引物 S8 附近,第 10 染色体定位到区间 IDP8526-bnlg1028 附近。两个群体的籽粒定位区间和穗轴花色苷定位的区间都一样，可见籽粒花色苷高的穗轴花色苷含量也高，二者有一致性。MuS-BC4F3、MoS-BC4F3两个群体的基因型确定通过定位结果的最近标记的带型进行确定，最后得出基因型个数的分离比符合孟德尔的遗传定律 9：3：3：1，说

10、明籽粒和穗轴花色苷的含量基因主要是受这两个非等位基因控制的。通过两个群体的籽粒和穗轴花色苷含量的方差分析发现不同基因型间玉米籽粒与穗轴花色苷平均含量差异显著，基因型不同籽粒与穗轴花色苷的平均含量也不同。两个群体的 9 种基因型花色苷平均值的多重比较表明，AaBb AABb AaBB AABB 四种基因型花色苷含量间差异不显著，这四种基因型的花色苷含量与 aaBb Aabb aaBB AAbb aabb 五种基因型花色苷含量差异显著，aaBb Aabb aaBB AAbb aabb 五种基因型I / 55花色苷含量差异不显著。可见当两个基因同时存在时对花色苷含量影响比较大，只有一个基因作用时对花

11、色苷的影响无明显差异。两个群体的籽粒和穗轴花色苷含量的两个基因上位性分析表明：一个基因单独作用时对籽粒和穗轴花色苷的影响都比较低，两个基因互作时对花色苷的影响比较大。可见基因互作对花色苷含量的提高有很大的作用。2.对群体 MuS-BC4F3叶脉叶耳颜色的进一步定位MuS-BC4F3群体表型鉴定表明，叶脉和叶耳的非紫色与紫色两种表型都 1:3，符合孟德尔单基因分离比例 1:3，说明可以排除其它基因的干扰，是对目标区段基因定位的理想材料。根据 F2 代和 BC4F2 的定位结果。加大叶脉叶耳基因附近引物的筛选力度，通过电泳筛选BC4F3 有差异的引物只有 3 对。为了定位的结果更准确需要多设计引物

12、。在叶脉定位的区间IDP8526-bnlg1028 和叶耳定位的区间 IDP8526-bnlg1028 由于叶脉叶耳都定位到一样的区间，所以设计的引物只要有差异在叶脉和叶耳上都可以用来定位，在 NCBI blastn 得知 IDP8526的 BAC 值 AC194430.3 ,bnlg1028 的 BAC 值为 AC205908.3，从 得知IDP8526-bnlg1028 之间的物理距离为 2,753,143bp,物理距离太大，需要通过设计新的引物来缩短物理距离。利用 SSRHUNTER 逐个寻找 SSR 位点，找到单拷贝的 SSR 位点，用 premie

13、r 5.0 设计引物，总共设计了 25 对引物，通过筛选发现引物 J34 在 SDM 与木 6 之间多态性比较好。用筛选出来的差异引物和新设计的引物对叶脉叶耳颜色进一步定位，最后叶脉叶耳都定位到区间 J34-bnlg1028，物理距离为 1304kb，极缩短了物理距离，为下一步克隆提供依据。BC4F3的定位结果的表型贡献率达到 60%以上，明显高于 BC4F2的定位结果，可见近等基因系BC4F3的定位结果准确度更高，可信度更高。玉米籽粒、穗轴花色苷含量两个显性基因的上位性研究与叶脉叶耳颜色的进一步定位The research of two dominant epistatic effect g

14、ene about Corn kernel and cob anthocyanins content and further gene positioning of vein and auricle colorPh.D.Candidate:Wenjuan YuanSupervisor:Prof.Yilin CaiAbstractAbstractCorn is one of the largest crop acreage in the world.The black corn has high anthocyanin content ,its an excellent care product

15、 for health,and it also has an important role in peoples health.The main ingredient of black corn is anthocyanin, and anthocyanin is the main water-soluble pigment which constitutes the color of the plant petals, leaves, fruits, seeds, and other organs.Anthocyanin is made from the aglycone and gluco

16、se in the form of a glycoside bond,which is a class of flavonoid polyphenolic compounds presented in plants widely.Anthocyanin has a variety of health functions, the main function of anthocyanin is scavenging free radicals, and it also includes the function of anti-aging antioxidant.So far,the resea

17、rch on corn epistasis mostly about corn plant height, ear height, total number of leaves per plant, leaf length, leaf width ear ear and ear leaf area, the epistatic effects analysis is also based on the corn sub-rate,but there is a little researsh on corn anthocyanins epistasis.The epistasis researc

18、h can enrich the genetic basis of anthocyanins,and provide the basis for gen improvement.The leave is an important part of the plant. Veins leaf and ear leaves are the important parts of the leave.They provide a reference for the further positioning of the leaf color gene and corn pigment basic rese

19、arch.They also provide a basis for corn pigment molecular marker-assisted breeding and corn pigment Cloning.In this paper, Southwest Institute of the University of corn breeding material black corn inbred lines SDM, wood, Mo17 SDM male parent as the female parent, build two backcross populations thr

20、ough the foreground and background selection to obtain two BC4F3 III / 55near-isogenic lines, two major gene control corn grain and cob anthocyanin content epistasis.The choose another SDM male parent, wood as the female parent, foreground selection and background selection for a genetic background

21、of near-isogenic lines BC4F3, further positioning veins auricles color, specific findings are as follows:1.Study of epistasis two dominant genes kernels and cob anthocyanin content to the two groups MuS-BC4F3 and MoS-BC4F3Grain anthocyanins content in two groups of MuS-BC4F3, MoS-BC4F3 on chromosome

22、 sixth are located near to the primer S8,The tenth chromosome are located near to IDP8526-bnlg1028.Two groups of cob anthocyanin content sixth chromosome location to the primer S8 near, near tenth chromosome location to the interval IDP8526-bnlg1028.The variance of the two groups of grain and cob an

23、thocyanin content analysis found that the average content of maize grain and cob anthocyanin significant difference among different genotypes, the average content of different genotypes of grain and cob anthocyanins are also different.Two groups of nine genotypes anthocyanin average multiple compari

24、sons showed that the AABB aabb AABB AABB four genotypes anthocyanin content difference was not significant, these four genotypes anthocyanin content and AABB aabb aaBB AABB AABB five kinds significant differences in genotype anthocyanin content AABB aabb AABB AABB AABB five kinds of genotype anthocy

25、anin content was no significant difference.Visible when the two genes at the same time the presence of anthocyanin content is relatively large, only one gene action anthocyanins was no significant difference.Two groups of grain and cob anthocyanin content the two genetic epistasis analysis showed th

26、at: a gene alone are relatively low impact on the grain and cob anthocyanins, two gene interactions anthocyanins comparison large.Visible gene interaction has a significant role in the improvement of anthocyanin content.2. Auricles and veins Color group MUS-BC4F3 further positioningThe MuS-BC4F3 phe

27、notypic identification showed veins and auricles non-purple and purple two phenotypes are 1:3, in Mendel single gene segregation ratio 1:3, can exclude the interference of other genes, the target area. paragraph gene mapping ideal material.According to the F2 and BC4F2 positioning results.Increase t

28、he veins leaves near the ear gene primers and screening efforts, by electrophoresis the BC4F3 differences primer only three pairs.In order to more accurate positioning results need to design primers.In veins positioning interval the IDP8526-bnlg1028 and auricles positioning interval IDP8526-bnlg1028

29、 vein leaf ears are positioned to the same interval, so the design of the primer as long as there is difference in the veins and leaf auricle can be used to locate in the NCBI blastn that the BAC value IDP8526 AC194430.3 the BAC value bnlg1028 AC205908.3, the 2,753,143 bp from . tha

30、t the physical distance between IDP8526-bnlg1028, physical distance is too large, need to design new The primer to shorten the physical distance. One by one to find SSRHUNTER SSR loci, to find a single copy of SSR loci Primers were designed using Premier 5.0, a total of 25 pairs of primers, primer J

31、34 in the SDM wood polymorphism is better found by screening.Screening out the differences cited material and new design of primers veins leaf ear color further positioning, last veins leaf ears are positioned to J34-bnlg1028 interval, the physical distance to 1304KB, greatly shorten the physical di

32、stance clone basis for the next step.The BC4F3 positioning results phenotypic rate of more than 60%, significantly higher than the the BC4F2 positioning, the positioning of the visible and near-isogenic lines BC4F3 results higher accuracy, higher reliability.第一章第一章 文献综述文献综述1.11.1 数量性状的相关概念数量性状的相关概念在

33、遗传机制制中，数量性状受多个基因来控制的，数量性状的基因对环境比较敏感，基因的作用与环境条件有关，关于数量性状的多基因假说是：数量性状基因是由多对微效基因联合作用的，各对微效基因的效应差不多，而且可以累加，也可以称这些微效基因为累加基因，由于每对微效基因对表型性状的影响较小，基因太多无法一个一个去辨认，只能将表型按照多基因体系来进行研究，微效基因之间的显性效应与隐性效应不怎么明显，一般用大写字母表示增效，小写字母表示减效作用。微笑基因对环境非常敏感，所以数量性状的表型性状容易受环境的影响，微效基因还有多个效果，不仅对数量性状产生作用还对其他别的性状有一定的作用。微效基因与主效基因间可以重组，连

34、锁等。数量性状基因与质量性状基因的异同之处：数量性状的变异是连续性的而质量性状的变异是不连续的，数量性状的基因的杂交后代不能明确分组，质量性状的基因的杂交后代可以按孟德尔定律进行分组，数量性状的基因受环境的影响较大，受环境的变化而变化，遗传力小，不能稳定遗传，而质量性状的基因是可以稳定遗传的。控制数量性状的基因在特定的时空环境下进明显，行表达，基因的表达因环境而不一样，有的环境表性效果比较明显，有的环境下表型效果不所以，数量性状基因经常存在与环境之间的相互作用。质量性状的基因受环境影响不明显，可以稳定遗传。质量性状的基因一般用概率的方法来进行分析也可以用系谱法来分析，数量性状基因的研究需要用统

35、计学和遗传学的方法来研究。作物的表型是由基因型，基因型与环境的作用和误差三者共同组成的，一般用三者的方差来计算表型的方差，前两者的方差是可以遗传的，误差方差是不可以遗传的。数量性状的基因经常存在一因多效的情况，生物体的数量性状间有一定程度的关联，采用协方差分析来分析这种变异情况。主效基因，微效基因，修饰基因都对数量性状有作用，数量性状的表型受这三种基因的表达，三种基因对数量性状的影响不同，主效基因的影响较大，对数量形状的表型起的作用相对来说比较大，一般情况数量性状是由几个主效基因共同控制的，修饰基因对表型的影响较小，主要是对主效基因起修饰的作用，而微效基因对表型的影响也很小，这些微效基因的作用

36、是可以累加的，对环境很敏感。基因的加性效应，显性效应，上位性效应的定义分别是，加性效应是等位基因的累加效应，是遗传中可以固定的因素，也称为育种值，显性效应是等位基因之间的互作效应，是遗传中不能固定的因素，可以产生杂种优势。上位性效应是指不同基因位点非等位基因间的相互作用。这三种效应在遗传育种中有不同的效应，加性效应在上下代之间可以稳定遗传，选择的过程中可以累加，可以很快将基因纯和，具有较高加性效应的数量性状通过世代选择容易达到育种的效果，显性效应与杂种优势有密切关系，在杂交育种中加以利用，但是这种显1 / 55性效应在逐代选择的过程中逐渐减弱最后消失，会影响育种中早代选择的效果，所以在育种中对

37、于以显性为主的数量性状以高代选择为主。上位性效应是由非等位基因间互作产生的，对数量性状的表型有很大的作用，加性效应加性效应互作产生的上位性效应可以遗传并逐渐固定，加性效应和显性效应产生的上位性效应与杂种优势有关，在低世代的育种时影响数量性状的选择效果。1.21.2 QTLQTL 定位的原理与方法定位的原理与方法.1 定位的原理定位的原理数量性状基因座是指控制数量形状的基因在基因组中的位置，QTL 定位的理论依据就是Morgen 的连锁遗传规律，利用分子标记定位 QTL，分析标记与目标 QTL 间的连锁关系。用交换律来计算。常用的分子标记有：RFLP，RAPD,AFLP,SSR,

38、SNP,等，RFLP 早期使用比较多，SSR 标记操作简单快捷，标记多态性高，适用于大批量的应用。.2 定位的方法定位的方法通过QTL与标记间的连锁关系，确定QTL于标记间的距离并将其定位到遗传图谱上，根据标记数目的不同分为单标记，双标记，多标记。统计方法有方差分析法，均值分析法，矩估计法，最大似然法。自20世纪60年代初提出单一标记分析方法以来，QTL定位方法有了长足的发展，已经发展了适合不同倍性1。与同源多倍体2。、连续性与间断性变量3、静态与动态性状、单一性状与多个相关性状联合4、单个组合与多个组合联合以与两个亲本与多个亲本甚至育成品种群体的QTL定位方法。常用的QTL作

39、图方法主要有单标记分析法，性状标记回归法，性状-QTL回归法，性状QTL回归法包括单区间作图法（The interval mapping IM） ，复合区间作图法（Composite interval mapping,CIM） ，多重区间作图法（Multifold interval mapping MIM） ，基于混合线性模型的复合区间作图法（Composite interval mapping based mixed linear model MCIM） ，完备区间作图法（Inclusive Composite Interval Mapping,ICIM） 。 区间作图法（Th

40、e interval mapping IM）是由个体目标性状观察值与双侧分子标记建立的线性模型的基础上，利用最大似然法，对标记区间的某一点可能存在的 QTL 进行检测，进而获得极大似然估计值。其遗传假设是，数量性状遗传变异只受一对基因控制，表型变异受遗传效应（固定效应） 和剩余误差（随机效应） 控制，不存在基因型与环境的互作。区间作图法可以估算 QTL 加性和显性效应值。与单标记分析法相比，区间作图法具有以下特点：能从支撑区间推断 QTL 的可能位置；可利用标记连锁图在全染色体组系统地搜索 QTL,如果一条染色体上只有一个 QTL，则 QTL 的位置和效应估计趋于渐进无偏； QTL 检测所需的

41、个体数大大减少。但 IM 也存在不足： QTL 回归效应为固定效应；无法估算基因型与环境间的互作（QE） ，无法检测复杂的遗传效应（如上位效应等）;当相邻 QTLs 相距较近时，由于其作图精度不高，QTLs 间相互干扰导致出现 Ghost QTL；一次只应用两个标记进行检查，效率很低。 复合区间作图法（Composite interval mapping,CIM）是 Zeng5 提出的结合了区间作图和多元回归特点的一种 QTL 作图方法。其遗传假定是，数量性状受多基因控制。该方法中拟合了其他遗传标记，即在对某一特定标记区间进行检测时，将与其他 QTL 连锁的标记也拟合在模型中以控

42、制背景遗传效应。CIM 主要优点是： 由于仍采用 QTL 似然图来显示 QTL 的可能位置与显著程度，从而保证了 IM 作图法的优点； 假如不存在上位性和 QTL 与环境互作，QTL 的位置和效应的估计是渐进无偏的；以所选择的多个标记为条件（即进行的是区间检测） ，在较大程度上控制了背景遗传效应，从而提高了作图的精度和效率。存在的不足是： 由于将两侧标记用作区间作图，对相邻标记区间的 QTL 估计会引起偏离; 同 IM 一样，将回归效应视为固定效应，不能分析基因型与环境的互作与复杂的遗传效应（如上位效应等） ; 当标记密度过大时，很难选择标记的条件因子。 多重区间作图法（Mult

43、ifold interval mapping MIM）针对以往作图方法的不足，C.H.Kao 和 Z.B.ZENG 利用 Cock 模型将 QTL 作图模型扩展到多重 QTLs 模型，一次可检测多个 QTLs,并可有效分析上位性。这种新的作图法被命名为多重区间作图法，它属于同时在多个区间上检测多个 QTLs 的方法，待估参数多，计算量大。所以 KAO 和 ZENG6利用 EM 算法推导出一个用于基因定位模型上估计 MLE 和其渐进变异矩阵的一般化公式，KAO7等以 Cockerham 模型8定义遗传参数并用该一般化公式作为估计方法，提出了多重区间作图法进行基因定位。突破了回归方法的局限性，在模

44、型中同时使用多个标记区间来寻找多个 QTLs。极提高了作图的精度和效率。但是 MIM 模型相当复杂，计算需要很长时间，待估参数的数目随着 QTL 的增大呈指数增长，而且如何确定合适临界值目前还没有现成理论，QTL 效应可能会被侧连标记区间之外的标记变量吸收，还有就是标记背景不同对作图结果影响很大，难以推广到上位性互作 QTL 的定位，章元明等研究认为，MIM 只能检测具有主效 QTL 间互作，对于效应小的 QTL 很难检测到。 基于混合线性模型的复合区间作图法（Composite interval mapping based mixed linear model MCIM）朱军9

45、提出了用随机效应的预测方法获得基因型效应与基因型与环境互作效应，然后再用区间作图法或复合区间作图法进行遗传主效应与基因型与环境互作效应的 QTL 定位分析。该方法的遗传假定是数量性状受多基因控制，它将群体均值与 QTL 的各项遗传效应看作为固定效应，而将环境、QTL 与环境、分子标记等效应看作为随机效应。由于 MCIM 将效应值估3 / 55计和定位分析相结合，既可无偏地分析 QTL 与环境的互作效应，又提高了作图的精度和效率。此外该模型可以扩展到分析具有加加、加显、显显上位的各种遗传主效应与其与环境互作效应的 QTL。利用这些效应值的估计，可预测基于 QTL 主效应的普通杂种优势和基于QTL

46、 与环境互作效应的互作杂种优势，因而其具有广阔的应用前景 完备区间作图法（Inclusive Composite Interval Mapping,ICIM）完备区间作图法10利用所有标记的信息，通过逐步回归选择重要的标记变量并估计其效应，然后利用逐步回归得到的线性模型校证表型数据，并利用校正后的数据进行全基因组的一维和二维扫描。完备区间作图法的优点是简化了 CIM 中控制背景遗传变异过程，ICIM 有较低的抽样误差，较高的作图效率，ICIM 对作图参数有很好的稳健性，有 QTL 的区域 ICIM 有显著的 LOD 值，反之没有 QTL 的区域 LOD 值为 0，容易推广到上位性

47、作图，在上位性作图时，不仅可以检测到有加性效应的 QTL 间的互作，而且还可以检测到没有明显加性效应的 QTL 间的互作。模拟研究和实际数据的分析表明完备区间作图法是一个有效的 QTL 定位方法。1 13 3 QTLQTL 定位方法的最新进展定位方法的最新进展.1 QTLQTL 动态定位动态定位单标记分析法、区间作图法、复合区间作图法、多重区间作图法等均是针对某一时间点数量性状观测值的QTL定位,即静态QTL定位(static mapping，SM)。静态QTL定位只反映了QTL从发育初始到观察时期的累积效应，难于掌握不同发育时期各个QTL的作用和提供有关QTL表达过程的信息。

48、为此，吴为人等提出了动态定位方法(dynamic mapping，DM)，又称与时间有关的QTL定位(timerelatedQTL mapping)11。该方法可以有效利用性状发育过程中的遗传信息，大幅度提高QTL定位的灵敏度和准确性，揭示QTL的表达动态瞄12。.2 eQTLeQTL 定位定位2001年Jansen等提出了eQTL定位方法13。即利用表型观测值、分子标记和表达谱数据定位出控制数量性状的基因。每一基因的表达谱作为一个性状，分析分离群体所有个体的表达谱，然后检测分离群体中标记与表达谱性状间的连锁。将表达谱作为数量性状所定位得到的QTL称为eQTL。当eQTL的遗传

49、连锁与该基因的位置一致时，便可确定与数量性状有关的基因。目前eQTL定位在酵母14、玉米和老鼠15等中得以应用。由于获得表达谱数据成本较高，该方法还未得到广泛应用。1.31.33 3 种质资源新基因发掘的种质资源新基因发掘的 QTLQTL 定位方法定位方法作物QTL定位群体一般是两纯合近交系的杂交后代，往往要求两近交系间差异较大。但是，若两者携带一样等位基因，即使其效应较大。也不能被检测到。因而，Rao等提出了增加亲本数目的四向杂交的QTL定位方法16。在老鼠QTL定位中甚至出现八向杂交17。目前种质资源新基因发掘的QTL统计方法主要包括关联分析、“in silico”方法和基于IBD的混合模

50、型方法。Grope等提出了一种“in silico”QTL定位方法，在15个近交系组成的群体中定位了老鼠疾病相关性状的多个QTL18。基于IBD的混合模型方法的主要思想是利用品种的系谱关系计算品种间的后裔同样值(identity by decent，IBD)，并将IBD值嵌入方差组分模型以定位QTL的位置与效应；然后，用最优线性无偏预测(best linear unbiased prediction，BLUP)法预测出各品种的QTL效应值。根据每一品种各QTL效应预测值，可进行新品种的亲本选配和分子设计育种，也可研究基因在品种中的传递规律19-20。Zhang等应用该方法定位了玉米GDUSHD

51、(growing degree day heat units to pollen shedding)的8个QTL20。.4 QTLQTL 精细定位精细定位实际研究中，由于受到费用和工作量的限制，初级作图群体一般都比较小，无论如何改进统计分析方法，也无法使初级定位达到很高的分辨率或精度。对于QTL精细定位，一般采取构建次级定位群体的方法，消除群体背景遗传因子的干扰。这些群体包括近等基因系、回交近交系群体21导入系群体22，或单片段代换系群体 23。这类群体是由供体亲本与受体亲本经过多代回交以后选育形成的，株系间除目的性状外遗传背景基本一致。应用近等基因系等次级定位群体可以将遗传背

52、景的干扰效应降低至最小，极提高QTL定位的精度。在此基础上，通过染色体登陆和行走，最终可以实现QTL的克隆24-25。近年来对作物QTL的研究发展很快，QTL定位方法在作物新基因源的挖掘，农作物遗传育种等方面发挥了很大作用。研究设计高效的QTL定位方法势在必行，包括建立新的作图群体、新的统计分析方法、以与以一种分子标记方法辅助的QTL选择等。只有这样，才能够全面认识和利用植物数量性状基因，服务于育种实践，加快育种进程。1.41.4 花色苷研究进展花色苷研究进展.1 花色苷研究现状花色苷研究现状近60多年来,对花色苷代的遗传学和生物化学进行了全面而深入的研究。植物花色苷的生物合成

53、是从莽草酸代途径合成苯丙氨酸和脂肪酸合成代合成丙二酰CoA开始，经苯丙烷类途径合成26。根据基因对花色苷生物合成的作用可分为结构基因和调节基因27。结构基因直接编码花色苷生物合成途径中的生物合成酶类如PAL、4CL、CHS、CHI、 F3H、DFR、F3H、F35 H、ANS、3GT等基因；另一类是调节基因，它们调控花色苷生物合成基因的表达强度和模式同时控制花色苷在时空上的变化，如AN1、AN2、JAFl3和ANL1等28。玉米是研究植物花色苷代途径并分离基因的重要物种之一，目前已有一些结构和调节基因被分离和克隆出来。玉米花色苷合成途径中已分离出的结构基因有5 / 55c2、whp、chi1、

54、pr1、f3h、a1、a2、bz1、bz2 29paz1990除此之外，在玉米中还分离出r、r(S)、r(Sn)、r(Lc)、b、c1、pl、vp1、in1、anl1、zm等调节基因30-31holton1995,petroni et al 2000，这些基因的编码产物并非花色苷合成途径中的酶，但是其表达水平，也会明显影响玉米植株、籽粒、穗轴等器官中色素的积累。有研究结果指出，在玉米籽粒颜色的进化过程中，调节基因的作用非常重要。早期有关玉米色素的研究与易于观察的色泽变异紧密结合，早在1900年以前，玉米红色和蓝色籽粒的分离现象就引起植物学家的重视，随后通过大量杂交试验，研究了玉米的色泽变异与基

55、因位点。Emerson32选择几种彩色玉米对其遗传进行了研究，基于完全连锁理论，认为玉米籽粒不同色泽之间不是独立遗传的。Hayes33认为玉米种皮的颜色受一系列复等位基因控制，而非2个或者更多的紧密连锁基因控制。Anderson34研究发现，某些有关玉米种皮颜色的基因在遗传上是等位基因或紧密连锁，有大量的基因参与性状的表达。Rhoades35研究基因剂量效应对玉米糊粉层颜色的影响，指出影响玉米糊粉层颜色的4个基因A1、c、R和A2必须至少各有一个显性基因，才能使糊粉层显颜色。丽娜等36通过徒手切片和分光光度法，研究玉米籽粒色泽的组成、分布和积累规律表明，不同颜色的玉米其色素组成和分布均不同；其

56、中2个黑玉米材料紫糯香和西星黑糯1号的籽粒色素成分主要是花色苷，且主要存在于糊粉层中。随着分子标记技术的应用，玉米色素相关基因的定位也取得了进展。Sourdille等37对含392单株的F2群体的叶缘、主茎、颖片和花丝等颜色基因的QTL定位，检测到8个位点，分别位于第2、第3、第4、第5、第7、第9、第10染色体，其中第2和第10染色体上的QTL对表型的贡献率最大。Brown等38利用IL731AW-6786W的F2：3群体，通过RFLP标记，对控制玉米叶片、果皮、茎秆等颜色的基因进行QTL定位，通过2年的表型鉴定，检测到2个与花色苷含量相关的QTL，位于第10和第5染色体，分别解释表型变异的

57、188和71。Lee等39刮用2个白玉米自交系(其中个自交系籽粒上有紫色条纹)构建了F2：3群体。采用58个SSR标记，2年重复检测到1个控制白玉米籽粒上紫色条纹的QTL，位于第6染色体，其最近标记为umc1979，从而推测控制PKS的基因就是与这个位点紧密相连的pll基因。黑玉米是玉米栽培中的一个变种，因籽粒中色素成分含量高而成黑色（紫色） 。花色苷是构成植物花瓣、叶片、果实、种子等器官颜色的最主要水溶性色素 40-41Klein et al., 1989; Tanaka et al.,2008，是由苷元与葡萄糖以糖苷键形式结合形成的一类广泛存在于植物体的类黄酮多酚化合物42-43（昶灵和郭

58、, 2007; 建霞等, 2009） 。.2 花色苷结构和代途径花色苷结构和代途径花色苷是花色素和苷元与糖以糖苷键形式结合，其结构母核是2-苯基苯并吡喃阳离子，属于类黄酮化合物。自然界已知的花色苷根据其结构上的差异可以分为22类 44-45(Andersen et al., 2002; Devia et al., 2002)，其中食品中常见的包括6类46(Escribano et al., 2004)。即矢车菊色素（50%） 、天竺葵色素（12%） 、飞燕草色素（12%） 、芍药色素（12%） 、牵牛色素（7%）和锦葵色素（7%） ，6 类花色苷的结构如图471.1 (Kong

59、 et al., 2003)。自然条件下花色素（anthocyanidins）通常与葡萄糖、木糖等糖类结合，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷在自然界中分布最广47(Kong et al., 2003)。黑（紫）玉米中所含的花色苷主要是矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-glu）, 矢车菊素-3半乳糖苷（Cy-3-gal） ，天竺葵色素-3-葡萄糖苷（Pg-3-glu）, 芍药色素-3-葡萄糖苷Pn-3-glu等48-49（Dpascual-teresa et al., 2002; Cevallos-casals et al., 2003） 。花色苷的生物代途径是目前研究的最为广泛和深入的植物次生代途径

60、50（Bartel and Matsuda, 2003） 。玉米、金鱼草和矮牵牛是研究花色苷代途径并分离基因的重要物种，代途径中的多数反应在三个物种中一样，在某些反应上不同的物种也存在差别。例如矮牵牛花通常情况下不产生天竺葵色素，玉米和金鱼草不能产生飞燕草色素。图 1.1 食品中主要花色苷的结构Figure1.1The main structures of anthocyanins in food花色苷 AnthocyaninR1R2矢车菊色素 CyanidinOHH飞燕草色素 DelphinidinOHOH牵牛色素 PetunidinOCH3OH锦葵色素 Malvidin天竺葵色素 Pela