中科院生物信息学期末考试复习题

1、中科院生物信息学期末考试复习题陈润生老师部分：1.什么是生物信息学，如何理解其含义？为什么在大规模测序研究中， 生物信息学至关重要？答：生物信息学有三个方面的含义：1） 生物信息学是一个学科领域，包含着基因组信息的获取、处理、存储、分配 、分析和 解释的所有方面，是基因组研究不可分割的部分。2） 生物信息学是把基因组 DNA 序列信息分析作为源头， 破译隐藏在 DNA 序列中的遗传语 言， 特别是非编码区的实质； 同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测；其本质是识别基因信号。3） 生物信息学的研究目标是揭示 “基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律” 。 它 是当今自然科学

2、和技术科学领域中“基因组、 “信息结构”和“复杂性”这三个重大科 学问题的有机结合。生物信息学是把基因组 DNA 序列信息分析作为源头，找到基因组序列中代表蛋白质和 RNA 基因的编码区；同时阐明基因组中大量存在的非编码区的信息实质，破译隐藏在 DNA 序列 中的遗传语言规律： 在此基础上， 归纳、 整理与基因组遗传信息释放及其调控相关的转录谱 和蛋白谱数据，从而认识代谢、发育、分化、进化的规律。同时在发现了新基因信息之后，其还利用基因组中编码区信息进行蛋白空间结构模拟和蛋白功能预测， 并将此类信息与生物体和生命过程中的生理生化信息结合，阐明其分子机制， 最终进行蛋白、核酸分子设计、药物设计、

3、个体化医疗保健设计。2. 如何利用数据库信息发现新基因，基本原理？答：利用数据库资源发现新基因，根据数据源不同，可分2 种不同的查找方式：1） 从大规模基因组测序得到的数据出发，经过基因识别发现新基因：（利用统计，神经网络，分维，复杂度，密码学， HMM ，多序列比对等方法识别特殊序列，预测新 ORF。但因为基因组中编码区少，所以关键是“数据识别”问题。）利用大规模拼接好的基因组， 使用不同数据方法， 进行标识查找， 并将找到的可能的新基因同数据库中已有的基因对比，从而确定是否为新基因。可分为：基于信号，如剪切位点、序列中的启动子与终止子等。基于组分，即基因家族、特殊序列间比较，Complex

4、ityanalysis， Neural Network 2）利用EST数据库发现新基因和新SNPs（归属于同一基因的EST片断一定有overlapping ,通过alignment可组装成一完整的基因，但EST片断太小，不存在数据来源，主要是拼接问题）数据来源于大量的序列小片段，ES侬短，故关键在正确拼接。方法有基因组序列比对、拼接、组装法等。经常采用 SiClone 策略。其主要步骤有：构建数据库；将序列纯化格式标准化；从种子库中取序列和大库序列比对；延长种子序列，至不能再延长；放入 contig 库构建若干数据库：总的纯化的EST数据库，种子数据库，载体数据库，杂质、引物数据库， 蛋白数据

5、库， cDNA 数据库；用所用种子数据库和杂质、引物数据库及载体数据库比对，去除杂质；用种子和纯化的EST数据库比对用经过一次比对得到的长的片段和蛋白数据库、 cDNA 数据库比较， 判断是否为已有序列， 再利用该大片段与纯化的EST数据库比对，重复以上步骤，直到序列不能再延伸；判断是否为全长cDNA 序列。（利用EST数据库：原理：当测序获得一条ES卅列时，它来自哪一个基因的哪个区域是未知的（随机的），所以属于同一个基因的不同 EST序列之间常有交叠的区域。根据这种“交叠”现象，就能找出属于同一个 基因的所有EST序列，进而将它们拼接成和完整基因相对应的全长cDNA序列。而到目前为止，公共

6、EST数据库（dbEST井已经收集到约800万条的人的EST序列。估计这些序列已覆盖了人类全部基因的 95%以上， 平均起来每个基因有10倍以上的覆盖率。）3 .用蛋白或核酸序列数据库研究生物演化的主要步骤是什么？当前的困难是什 么，如何克服？（核酸或氨基酸序列进行进化研究要进行哪些计算步骤？当前 遇到什么问题？怎样解决？）答：计算步骤，构建系统进化树，其主要步骤如下：1）序列相似性比较。就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST FAST%;2）序列同源性分

7、析。是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有CLUSTA管；3）构建系统进化树。根据序列同源性分析的结果，重建反映物种间进化关系的进化树。为完成这一工作已发展了多种软件包，如PYLIP MEGA等；4 ） 稳定性检验。为了检验构建好的进化树的可靠性，需要进行统计可靠性检验，通常构建过程要随机地进行成百上千次，只有以大概率（70%以上）出现的分支点才是可靠的。通用的方法使用 Bootstrap算法。 （1.序列相似性比较：就是将待研究序列与

8、DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该 序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么，完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的序列包有BBLAST FASTA?;（2.序列同源性分析：将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进 行多序列同时比较，以确定该序列与其他序列间的同源性大小，这是理论分析方法中最关键的一步，完成这一工作必须使用多序列比较算法，常用的程序包有CLUSTA等；（3.构建系统进化树：根据序列同源性分析的结果，重建反应物种间进化关系的进化树， 为完成这一工作，已发展了多种软件包，如 PYLIP MEGA等（4.稳定性检验：为了检验构建好的进化树的

9、可靠性，需要进行统计可靠性检验，通常 构建过程要随机地进行成百上千次，只有以大概率（70%以上）出现的分支点才是可靠的。通用的方法使用 Bootstrap算法，相应的软件已包括在构建系统进化树所用的软件包当中。】当前的主要困难：是发现了基因的横向迁移（LGT）现象，即进化程度不同的物种间存在着遗传信息基因的传递，如果拿迁移的基因做进化分析就会出错。克服LGT的方法（可能的解决途径）：1）纵向思路：选择垂直进化而来的序列进行研究，即去除横向讦移的数据库：如COG数据库;2）横向思路：发展基于完整基因组构建展化树.即使用全基因组数据库讲行基因组水平上的对比;利用生物体的蛋白质组构建进化树。选取特征

10、对比，不同长度的序列字符串进行对比后，对照其genome进行归一化；ORF对比，将all predicted ORF采用COG的分类规则进行分类，再构建进化树4.什么是SNR为彳f么SNP的研究是重要的？ SNP研究有哪些优点？举出23个SNP相关的网站。答：SNP是指单核甘酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核甘酸的变异所引起的DNA序列多态性，代表了基因组水平上遗传密码的变异，由于这种变异很多以单碱基突变的形式出现，因此称为单核甘酸多态性；它反映了不同个体间、正常与异常个体之间基因组上的差 别，现在这个概念有所扩大，不限于一个核甘酸的差异。重要性：因为SNP研究是基因组领域理论成果走向应

11、用的关键步骤，是联系基因型和表现 型之间关系的桥梁，是研究人类基因组计划走向应用的重要步骤。优点：(1) SNP在基因组中分布相当广泛，使人们有机会发现与各种疾病相关的基因组突 变；(2)不直接导致疾病基因表达的SNP,与某些疾病基因相邻，成为重要标记，有助于发现疾病基因(3)从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变，比通过家系发现更加容易。(4)基础研究中非常重要，如对 Y染色体SNP分析有重要成果。SNP的特点：1 .位点丰富2 .具有代表性3 .遗传稳定性4 .易于进行自动化，规模化分析，缩短了研究时间 SNP研究的意义：通过大批量、高通量的SNP的发现与鉴定，人类SNP- Hap

12、lotype遗传图谱的构建， 在 连锁不平衡基础上的关联分析等，有望为人类致命基因的寻找和疾病的防治提供快速和有效的途径，一系列发现和检测SNP的方法，构建图谱的策略，及连锁不平衡和关联分析等技术，正在动植物研究领域中受到广泛的关注，毫无疑问将在分子和群体遗传、动植物育种和生物进化等研究领域中发挥越来越大的作用。SNP相关的一些网站：1) SNP Consortium's database。2) NCBI SNP database将这些数据进行整理，去掉冗余，使每个SNP都是唯一的。此时的SNP被称为 reference SNP 或 refSNP。()3) The Human Geni

13、c Bi-Allelic Sequences Database(HGBASE)这一数据库收录了人基因组中 所有已知的序列变化，包括：SNPs序列的插入和缺失(Indels)、简单重复序列等。()4) The Human Gene Mutation Database ( HGMD)()5) The Protein Mutant Database(PMD),蛋白突变数据库。收录了蛋白质特定位点的氨基酸 突变信息，以及这些突变对蛋白质结构功能的影响。()_6) The Allele Frequency Database(ALFRED)人类群体等位基因频率数据库，5.什么是系统生物学？系统生物学对生命

14、科学概念上的发展？系统生物学对生 物功能实现的理解有何本质变化？系统生物学的研究思路是什么？ 答：系统生物学是指在系统的层面上研究生命活动。(研究一个生物系统中所有组成成分的构成，以及特定条件下组分间互作关系。)【系统生物学就是自基因组研究以来，各个层次的所有资料和数据 (包括基因组测序数据，功能基因组数据，蛋白质三维结构信息以及相互作用的数据等)的整合，以及这些整合数据为基础建立数学模型，再以这些模型模拟仿真研究生命活动的影响之后生命活动的反应以及变化】包含三个相互衔接的组成(三部曲)：整合数据，即整合所有各个层次( DNA水平，RNA水平，蛋白质水平，蛋白质相互作用水 平)的信息数据；系统

15、建模，即用这些信息构建描绘生命活动的数学模型；（生命活动及外界因预测未知， 即用这个模型预测生命未来的发展及外界干扰后系统的变异素变化对其产生的影响）。学术概念上的发展主要有：传统生物学是从基因组序列到结构， 再到功能， 而它从各个层次的相互作用到网络， 再到功能。 与以往不同的是， 系统生物学一开始就考虑元件之间的相互作用， 把整个生命活动作为网络，考虑其相互作用。1）研究思路的变化：传统的分子生物学研究步骤一般为：DNA序列-蛋白结构-蛋白功能（一维），而系统生物学是在二维的角度研究生命科学，即：相互作用-网络-功能，是由一组基因产生并相互作用共同实现的。2） 看待生命活动本质的变化： 因

16、为没有一个生命活动是靠一个基因完成的， 生命活动是一组基因相互作用实现的， 这种相互作用形成一个网络， 既包括每个单元的结构， 又包括单元与单元之间的相互作用。 因此， 系统生物学不仅考虑每个基因的活动， 还描述了基因间的相互作用并导致了网络的产生。 （系统生物学与传统生物学看待生命活动有着本质的不同： 系统生物学认为生命活动是由一组基因及其相互作用来实现其过程的，这种相互作用形成了一个网络， 既包括每个单元的结构， 又包括单元与单元之间的相互作用， 因此在考虑结构的过程中考虑其结构间的相互作用， 一组一组地研究。 而传统的分子生物学考虑的只有结构，是一个一个地去研究。）其对生物功能实现的理解

17、发生了本质性变化 ：它不仅考虑单个分子而且考虑其间相互作用， 把整个生命活动作为一个相互作用的网络来研究其功能，基因组只是网络中的一部分，只有通过相互作用的网络才能体现功能；通过系统地整合生物过程不同阶段的分散数据，如基因组，转录组，蛋白组，代谢组，可以对复杂的生物过程， 如折叠、信号传导途径、 代谢途径更好地模拟，研究生物过程的动态变化；它不仅全息的了解复杂的生命系统中的所有成分以及他们之间的动态联系， 还可以预测如果这个系统一旦受到了刺激和外界干扰，系统未来的行为是什么。系统生物学与传统生物学有什么不同：区别：传统生物学：序列-结构-功能，只考虑单个个体，单个 gene,单个蛋白质系统生物

18、学：相互作用-网络-功能，除考虑单个个体，单个 gene,还考虑个体与 个体之间的相互作用，把整个生命活动作为一个网络来考查它们的相互作用。（传统分子生物学是从基因组中发现特殊序列， 即基因， 然后找到基因编码的蛋白， 再通过测知其结构，而知其功能。而系统生物学研究是从各个层次的相互作用到网络，再到功能。系统生物学不仅考虑单个分子， 而且考虑其间相互作用， 认为生命活动由大量相互作用的结构单元组成， 这些结构单元形成网络。 基因组只是网络中的一部分， 只有通过相互作用的网络才能体现功能。它不仅全息的了解复杂的生命系统中的所有成分以及他们之间的动态联系，还可以预测如果这个系统一旦受到了刺激和外界

19、干扰，系统未来的行为是什么。）系统生物学与分子生物学有什么不同：区别：分子生物学：序列-结构-功能，只考虑单个 gene,单个蛋白质系统生物学： 是研究生物系统组成成分的构成与相互关系的结构、 动态与发生， 以系统论和实验、 计算方法整合研究为特征的生物学。 系统生物学不同于以往仅仅关心个别的基因和蛋白质的分子生物学， 在于研究细胞信号传导和基因调控网路、 生物系统组成之间相互关系的结构和系统功能的涌现。系统生物学的研究思路（研究流程）：1 .针对选定生物系统进行实验设计，了解系统所有组成成分：基因，RNA,蛋白，膜脂等2 .通过系统行为动力学分析，总结系统设计和控制规律3 .通过总结规律来提

20、出新的实验设计，验证系统模拟的正确性【分子生物学与系统生物学的区别与联系？答：二者的区别和联系主要从宏观和微观上讲。分子生物学的研究采用典型的还原论方法，研究对象主要是分子水平上的， 即生物系统中的大分子、 信号分子的结构、 生化性质以及功能，基因表达过程中的调控，以及DNA 重组。分子生物学只研究系统的组成元素，最后给出系统的组成元素清单， 它是系统生物学的基础， 但它的研究结果只能解释生物系统的微观或局部现象， 无法说明系统整体所具有的功能从何而来。 而系统生物学作为一个整体， 表现出完善的整体行为， 而组成系统的细胞、 基因、蛋白质等只能作为系统的一个构件、一个元素、通常情况下它无法表现

21、出“系统”行为。系统生物学与分子生物学研究对象不同，系统生物学研究的是系统整体，研究由系统元素形成有功能的整体所依赖的组织方式和潜藏规则， 它同时研究系统的不同层次， 以及他们之间的相互作用关系， 并将这些整合起来深刻挖掘系统整体的功能形成机制。系统生物学虽然在研究对象上与分子生物学不同， 但他们之间并不是完全不相关的， 系统生物学的研究离不开分子生物学研究所给出的大量资料和数据， 正是依赖这些， 系统生物学才有了建模的基础。 同时分子生物学的研究结果只有通过系统生物学进行整合才能从理论上对系统的宏观性质达到定性定量的理解， 反过来， 系统生物学的研究成果也可以用来指导分子生物学的实验设计。

22、因此二者之间其实是相互补充的， 只有结合起来， 才能充分认识生命现象。】6. （1）什么是非编码序列，非编码RNA,非编码基因？（ 2）以人的基因组为例回答：在基因组中有多少非编码序列，有多少存在转录本，举 23 个非编码核酸的生物学功能？答： （ 1） 非编码序列 是基因组中不编码蛋白质和多肽的序列；（基因组中不归属于基因调控元件， 稳定元件之外的， 也无明确生物学功能意义的基因序列统称为非编码序列， 即不编码蛋白质同时也无明确生物学功能的序列 ）非编码 RNA 是指来自基因组的非编码的转录元件， 即基因组中非编码序列的转录产物/转录本；非编码基因 指那些具有明确生物学功能的非编码RNA 在

23、基因组上非编码序列上的位置，即功能性的非编码RNA 对应基因组上的位置称为非编码基因；（2）人类基因组中9798%的序列是非编码序列，有70%80%存在转录本，非编码核酸的生物学功能：1） Xist:X-inactivation （ X 染色体失活）是哺乳动物的一种剂量补偿机制，其中一半拷贝转录被抑制从而失活，抑制转录是通过一个2kb 的非编码 RNA （ Xist RNA ）实现的 ,xistRNA 装配在失活X 染色体的外侧，引起结构改变导致失活；2） Small RNA and RNAi: RNAi 是由 RNA （ siRNA 、 microRNA ）导致的转录后基因沉默现象，如由双链

24、小RNA 引起的干扰和转录后基因沉默现象，在植物病毒抗性和线虫中的转座子沉默；一些小核RNA 调控基因转录。 （单链易降解，但发现细胞中存在另一种pathway， 双链小RNA 进入细胞后结合组蛋白形成复合体，该复合体和识别并降解 target）3） piRNA （具有大量转录本，功能不详）和 Prions （生物复杂度到一定程度后会出现发病情况，可能和非编码RNA 有关）等。7 .什么是基因组中的非编码区？请以人类基因组为例，说明：（ 1）非编码区所占的比例？（ 2）按在基因组中的位置（组成）（功能）区分，非编码序列有哪些组分？它们所占比例如何？（ 3）按序列编码特征区分，非编码序列有哪些组

25、分？它们所占比例如何？（ 4）请说明非编码区研究的重要性（可以举出一、两个典型非编码序列作为例子）答： 基因组中不能编码蛋白质的区段叫做非编码区。 非编码区位于编码区前后， 同属于一个基因，控制基因的表达和强弱 。（ 1 ）人类非编码区占 97 98%（ 2 ）按照在基因组中的位置（组成）来分，各个组分占基因组的份额：编码基因（编码蛋白质和 tRNA 、 rRNA ）：1.5 2% ；Intron （广义）：25% ；端粒、中心粒等特定位置： 12% ；基因间序列：60 70% ；按照在基因组中的功能区分，各个组分占基因组的份额：功能蛋白质基因1.7% ，功能RNA 基因0.5% ，总共大约1

26、 3% ；内含子： 24% ；Satellite DNA（ 主要分布在中心粒和端粒 ）: 12% ；基因间序列（ Intergene DNA ）：60 70% ；（ 3 ）按照序列特征区分，各个组分占基因组的份额：编码区（包括编码蛋白质和tRNA 和 rRNA 的基因）占总基因组的 2% ；非编码区占到 98% ：其中：简单重复序列：12% ；散在重复序列：45% ；假基因 :1% ；非编码非重复序列：35 40% ；（4）举例：非编码基因： 1.SINE 作为调节源，调节基因重组、交换，丰富多样性，获得新功能；2 . 鸡溶菌酶基因中，位于编码区上游的 CRI 元件起着转录沉默子的作用；3 .

27、nc DNA 产物有重要生物学功能， 如 tmRNA 介导错误翻译蛋白的降解RNAi 导致基因沉默非编码基因产物的功能： smallRNA 是 nc DNA 产物，是机体固有的，例如： microRNA ，SiRNA 小 RNA 对染色质的形状有关，也可直接关闭或删除部分DNA 。 NcRNA 起着非常重要的生物学功能，如影响发育过程，调节转录、影响染色体复制、对RNA 加工修饰、影响mRNA 稳定性进而影响翻译、甚至影响蛋白降解转运；Xist 介导 X 染色体失活是通其编码的一个大的剪接过的多聚A 非编码产物进行的。（长链非编码 RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA分

28、子，它们并不编码蛋白，而是以 RNA 的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。IncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是 RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明， lncRNA 参与了 X 染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程， lncRNA 的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。哺乳动物基因组序列中约4%9%的序列产生的转录本是IncRNA （相应的蛋白编码RNA的比例是1%）,虽然近年来关于IncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的 lncRNA 的功能仍然是不

29、清楚的。）（ 已有的研究结果表明，在高等生物中，小分子非编码RNA 在干细胞干性维持、胚胎发育、细胞分化、凋亡、代谢、信号传导、感染以及免疫应答等几乎所有重要生命活动中发挥关键的调控作用，提示生物体内可能存在着由 RNA 介导的遗传信息表达调控网络。）8 .精准医学的重大意义是什么？实现精准医学的重要基础是什么？精准医学的重大意义； 精准医学有可能导致医疗体系本质上的转变， 把目前的医疗体系由诊断治疗过渡到健康保障， 使得健康体系的关口前移， 有可能产生新兴产业。 健康人可以通过组学等一系列研究， 对现在的健康作以评估。 在健康检查的基础上， 对未来可能导致疾病的部分进行干预，使得能够延缓疾病

30、的发生，或者排除某些疾病的发生，使得健康得以保障。实现精准医学的重要基础：1 .必须获取分子水平上的数据信息，并挖掘其内涵，在挖掘组学数据时，一定要使用大数据分析技术， 因此是大数据与组学的交汇。 组学包括基因组， 转录组， 蛋白质组， 代谢组； 大数据包括人群和队列2 .建立分子水平上的知识与宏观疾病表型的联系，即基因型和表型的关联，搭建分子水平信息和疾病间的桥梁， 在搭建桥梁时， 生物信息学，生物网络， 系统生物学的知识是其核心知识。3 .在此基础上，融合临床检验，影像学等指标，使得医学做得更加精准。【定义： 精准医学是以个体化医疗为基础、 随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科

31、学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。本质上： 是通过基因组、 蛋白质组等组学技术和医学前沿技术， 对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标志物的分析与鉴定、 验证与应用， 从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确亚分类， 最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益。精准医学是因人因病而异的、 更加精确的个体化医疗， 其进步之处是将人们对疾病机制的认识与生物大数据和信息科学相交叉， 精确进行疾病分类及诊断， 为疾病患者提供更具针对性和有效性的防疗措施，最终目的是更好地为患者服务。与个体化医疗相比，精准医疗更重视“病”的深

32、度特征和“药”的高度精准性；是在对人、病、 药深度认识基础上， 形成的高水平医疗技术。 精准医学实现了从诊断治疗到健康保障这一本质性转变。精准医学包括精准诊断和精准治疗， 而 “迈向精准医学” 需要构造的生物医学知识网络是建立在系统生物学的基础之上。实施精准医学计划的战略意义总共有4 点：提高疾病诊治水平，惠及民生与国民健康;推动医学科技前沿发展，增强国际竞争力；发展医药生物技术，促进医疗体制改革；形成经济新增长点，带动大健康产业发展。】【有可能将基因组变异作为疾病诊断， 精准医学导致医疗体系本质的转变， 把目前阶段 治疗过渡到健康保障，使健康体系关口前移， 在健康筛查基础上， 排除疾病发生。

33、就是评估 -检查-干预的过程。基础：1获取分子水平上数据信息，挖掘信息内容，发展大数据新算法，理论技术如组学的信息。2建立分子水平知识宏观疾病表型关联，搭建分子水平信息与疾病的桥梁。问题：样本量少，有效治疗事件频率低，疾病相关复杂网络构建分析的困难。】陈小伟老师部分:1 .芯片间标准化的方法:而可以得到Averaged求排的平均值作为标准值Re-ordered重排：按颜色重排基本方法：芯片间标准化的目的是基于Gene1Gene5五个基因表达量理论的和应该保持恒定，即S1S3三列每一列的和是相等的。但实际测定过程中不可能完全相等，因此将这种不等归结于每一组芯片自身的差异而进行芯片间标准化，基本步

34、骤为通过排序取平均重新排序的方法消除芯片间误差，从而可以得到每一组基因表达量的真实值。（老师给的这组芯片基因完全相同的情况下 S3一列数据明显偏高，通过这种标准化实现了芯片间差异的消除）。Quantile归一化过程：首先假设不同芯片整体分布一致，归一化后芯片的分布一样。下图四个部分代表四步，行代表基因，列代表样本，图一对每个列的表达值排序，图二计算每行的平均值，图三用每行计算的平均值代替该行的原值，图四将排序后的行恢复到未排序前的位置。】2 . FDR控制假阳性白方法Benjamini -Hochberg procedure基本方法：对于m个独立的样本，其 p-value记为Pi, i=1,2

35、,3 91(1)对所有的p-value进行从小到大排序 p(1)< (2) <(m)；(2)对于一个给定的“(此时的a即为统计里的显著水平，范围01,通常取0.05),找到最大的k值，满足(3)拒绝从p(1)p(k)的无效假设Ho (即表示p(1)p(k)表达量存在显著差异)。Genep-valuuGlPi =)033G2P1 =0,001G3P. 0Q5G+P4 =503G5P; =0 D2G6P6-O.D1Genep-vajueG2 uRUQPpjO.OlG5P f .02G4p=00?G3P ：l=0 045G1P网=00%GenePq-valueG2P= 0.0010.00

36、6G6p0=OO10 03G5Ppj =0.020.04G4P 二。030.045G3P 二 00450054G1P(6 =0.0530.053计算方法1 ( a =0.05 :P(4)=0.03<0.05*4/6=0.033; P(5)=0.045>0.05*5/6=0.041;k=4.即 G2, G6, G5, G4差异表达,FDR<0.05计算方法2 (q-value法)：根据式 登可以推出0t W 等?因此直接计算并与a进行对比即可:由于G3的q-value大于0.05,因此G2, G6, G5, G4差异表达。【FDRi±程，如何控制 FDR首先，FDR过

37、程是为了控制假阳性率的过程。假阳性指样本本质为假但判定为真。比如在找到一组差异表达的基因之后，我们要考虑这个差异是否够显著，即假阳性率是否足够低。G»ne expression dl31tsi isinalysis Microarray data analysis procedureI Intensity IBenjarpini-Hochberg procedure (BH)values 5re rFor f九 independent tests, the p-1. Order p-values in increasing order 声】3 Po ''' t

38、n >2. For a given or e (o. I), find ihe4 largest k :such that /一心) -L3. Then reject (i e. declare positive discoveries) all J 二三心BH过程是FDR矫正的一种，首先对检验得到的P值进行排序，然后从1开始增加找Ka-fcPg "的值，使K满足网,其中m为个数，a一般取0.05或0.1。所有满足P值的基因认为表达有显著差异且假阳性不超过a。】3.转录本表达量的表示方法( RPKM : Reads Per Kilobase of transcript per

39、Million mapped reads ): 1） RPKM的作用：RNA-seq是透过次世代定序的技术来侦测基因表现量的方法，在衡量基因表现量时，若是单纯以map到的read数来计算基因的表现量，在统计上是一件相当不合理的事，因为在随机 抽样的情况下，序列较长的基因被抽到的机率本来就会比序列短的基因较高，如此一来，序列长的基因永远会被认为表现量较高，而错估基因真正的表现量，所以 Ali Mortazavi等人 在2008年提出以RPKM在估计基因的表现量RPKMtotal exon readstotal mapped reads (millions) * exon length (KB)假

40、设一个物种的基因组上只有两个基因，基因 G1的外显子长8 Kb,基因G2的外显子长2Kb。对该物种的一个样本做RNA-seq,共得到23 millions的read,其中能够比对到 G1的read有16 million 个，能够比对到 G2的有4 million 个.计算G1和G2的RPKM。Total mapped reads=16 million+4 million=20 millionG1: total exon reads=16,000,000 exon length=8kbRPKM=16,000,000/(20*8)=100,000G2: total exon reads=4,000

41、,000 exon length=2kbRPKM=4,000,000/(20*2)=100,000 2） 2） FPKM 与 RPKM 的区别：两者基本相同。 RPKM 代表 Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads ， FPKM 代表 Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads 。在 RNA-Seq 中， 由于 cDNA 来源于 RNA 的逆转录， 转录物的表达量与cDNA 片段成比例。 RNA-Seq 配对末端实验每个片段产生两个read

42、s,但这并不意味着两个reads都可在图上标注。例如，第二个 read低品质。如果我们对read 计数而不是片段，我们可能对某些片段重复计数，而对另一些只计一次，导致对表达量估计的偏差。因此 FPKM以片段为单位计数，而不是 reads数。（来源于 网上，原网址：）预测：1 .高通量测序数据分析总括：高通量测序数据库程序读出的reads数据及对应的质量分彳1以文件格式为fastq的格式保存。测序的原始数据为荧光信号， 首先将荧光信号转换为序列信息， 即读段数据及对应的质量分值；为了方便测序数据的发布和共享， 一般需要对数据进行格式化转换， 最常用的数据格式为fastq 格式；对得到的原始数据必

43、须对其质量进行评估，评估指标包括G、C含量，碱基质量，插入分布等。方便过滤掉质量较差的读段；若数据质量评估过关，接着将原始读长通过序列映射定位到基因组上；若无参考基因组，则必须使用denovo 的组装方法；得到测序数据的组装图后， 便可根据实验目的对组装好的数据进行相关分析， 如分析基因的剪接位点， SNP 位点，变异位点还可以分析基因的差异化表达（RNA-Seq ），转录因子结合位点（Chip-Seq）,甲基化模式（MeDIP-Seq ）,同时还可利用此数据发现新的编码基因和非编码基因；使用可视化组件对分析结果进行可视化处理。2 .表达谱数据分析流程Intensity fExpression

44、 pro control f Normalization fDifferential gene expression analysis基因芯片在一个颜色通道扫描后得到的原式图是色调单一，强度不同的亮点陈列图；将原始的图像数据转换为基因表达矩阵；对得到的基因表达矩阵的数据质量进行检测， 对得到的数据进行统计学分析， 从而估计和校正试验误差，筛选出有效数据。标准化就是消除基因芯片实验过程中系统变异对基因表达水平所带来的影响。 标准化包括芯片内的标准化和芯片之间的数据标准化。 芯片内的标准化方法， 如局部加权线性回归标准化，参照点标准化，芯片之间的标准化方法如 Quantile ；前几部都是对表达谱

45、数据的预处理，后期的数据分析包括差异基因表达分析、聚类分析、判别分析等；a）差别基因表达分析可分析不同样本中起关键作用的基因，为后续研究提供方向；b） 聚类分析是基因表达谱最广泛使用的统计技术， 聚类分析的目的再与寻找可能标准化或关联的基因，从而预测位置基因的功能信息或已知基因的未知功能；c）判别分析能够依据样本的某些特性，判别样本的所属类型，利用已有数据建立分类器，然后利用建立的分类器对未知样本的功能或状态进行预测。方法主要有SVM ，贝叶斯分类和神经网络法等。3 .无生物学重复和有生物学重复时如何进行差异表达分析？答： （ 1）无生物学重复：方法： FC（ Fold change 倍数变化

46、）描述数据初值与终值之间的差异 （一般是两个差别表达基因间或处理与对照之间） ， 用标准化后的两组数据相除得到的比例，一般2-fold 表明两组数据是有显著差异的；这种计算方法可以得到一组相对值， 而不是绝对值变化， 消除了系统误差以便于统计学分 析；一般得到的 FC 值与设定的阈值进行比较即可得到表达有差异的基因； （ 2）有生物学重复：方法：假设检验a）具体步骤：提出实际问题；提出无效假设（Ho）与备择假设（Hi）；选择显著性水平（一般 产0.05）;选择统计模型与相应的统计量；根据实验结果计算实验统计量； 判断检验统计量的p-值（表示事件发生的概率具有偶然性）；将p值同选定的显著性水平比

47、较；拒绝或不拒绝Ho；回答所提出的实际问题。b）假设检验根据数据类型（是否符合正态性）分为参数检验与非参数检验：参数检验：符合正态分布可使用，常用的方法主要有t检验法，配对t检验法、最小二乘法非参数检验：不符合正态分布可使用，常用的方法有Wilcoxon秩和检验法，其基本方法是根据表达量排序并按照排列顺序检验，检验结果较参数检验法更粗犷。4 .全基因组测序的步骤？答：（ 1）第一期：基因组调研图整体测序深度不低于2o 倍覆盖度。进行初步的数据分析，对基因组大小， GC 含量等做出初步评估，确定框架图梯度文库构建具体策略；（ 2 ）第二期：基因组框架图基因组覆盖度达到 9o% 以上，基因区覆盖度

48、达到 95% 以上，单碱基的错误率达到 1 万分之一以内，整体测序覆盖深度不低于6o 倍覆盖度。同时对框架图进行基本基因注释和功能注释，和简单的比较基因组学分析。（ 3 ）第三期：基因组精细图基因组覆盖度达到 95% 以上，基因区覆盖度达到 98% 以上，单碱基的错误率达到 1o 万分之一以内，整体基因组覆盖度不低于1oo 倍， Scaffold N5o 大小不低于3ooKb ，对基因组精细图进行详细基因注释，基因功能注释，基因代谢途径注释和比较基因组学分析。5 . 转录本测序，各数据分析工具的特点？转录本测序可分为 Small RNA-seq 和 RNA-seq ： Small RNA-se

49、q 主要用于检测small RNA （主要是 miRNA ）的表达水平，发现新的 smallRNARNA-seq ： Poly(A)用以检测蛋白质编码基因的可变剪切体及表达水平；Total RNA (除rRNA)用于检测 mRNA及long noncoding RNA 的表达水平并发现新的 long noncoding RNA ; 数据分析工具主要有： Bowtie, TopHat, Cufflinks ,具体作用如下：a)Bowtie是一个超级快速的，较为节省内存的短序列拼接至模板基因组的工具。它在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。Bowtie并不是一个简单的拼接

50、工具，它不同于 Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取 1024个碱基的片段。b)TopHat是一个快速的将RNA-Seq数据进行快速剪接映射的程序。它使用超快的高通量短 读比对程序，将 RNA-Seq的信息比对到哺乳动物大小基因组上，然后分析映射结果来鉴别 外显子之间的剪接点。c)Cufflinks 利用Tophat比对的结果(alignments)来组装转录本，估计这些转录本的丰度，并且检测样本间的差异表达及可变剪接调控。它通过接受线性的 RNA-Seq reads并将线性片段组装为一套最大简约的(parsimonious)转录本。然后根据reads数估计估计

51、相关转录本的丰度并将实验室预设的偏差考虑在内。6 .转录本拼接最大简约转录本的组装方法：组装一套转录本一在链中找到最小的分割单元P一-找到最大的反义链一在二分图中找到最大匹配数一找到最小点覆盖二分图：指顶点可以分成两个不相交的集使得在同一个集内的顶点不相邻(没有共同边)的图。设G=(V,E)是一个无向图，如果顶点 V可分割为两个互不相交的子集 (U,V),并且图中 的每条边(i, j)所关联的两个顶点i和j分别属于这两个不同的顶点集 (i in U,j in V),则称 图G为一个二分图。最大匹配：给定一个二分图 G,在G的一个子图M中，M的边集中的任意两条边都不依附于同一个顶点，则称 M是一

52、个匹配，选择这样的边数最大的子集称为图的最大匹配。最小点覆盖：给定一个二分图G,在G的一个子图N中，N的点集中的点与所有的边都有关联(把所有的边都覆盖)，则称N是一个点覆盖，选择这样的点数最小的子集称为图的最小点覆盖。7 . Illumina测序原理在聚合反应体系中加入修饰过的四种核甘酸，它们分别被标记上终止基团和荧光基团：3'羟基上标记上叠氮基一一在延伸时起阻止聚合的作用，胞喀呢上标记 上荧光基团。每一种核甘酸标记的荧光分子是不一样的。聚合终止，每次加入一个修饰核甘酸，链聚合就被终止了，如下图用激发光照射，被修饰的碱基发出荧光，记录荧光信号，则知这一步加入的是 什么核甘酸。延伸回复：

53、加入二琉基丙醇去掉叠氮基；用TCEP(Tris (2-carboxyethyl) phosphine,三（2-竣乙基）瞬）处理，去掉荧光基团。进入下一轮延伸，加入一个新的碱基。原理的关键之处在于如何形成足够强的荧光信号。无疑这需要大量的模板。怎样来获得大量模板呢？同时二代测序技术还要实现高通量测序， 即同时对大量 序列测序。如何将混合样品中序列彼此分开呢？ 川umina桥式PCR技术可解决以 上两个问题（1）样品准备 序列片段化：将混合样品中的核酸序列打断至 400bp左右短序列收集，并将末端补平。在 5'端加一个Pi基团；3'端加一个“A”在两端分别加上不同的接头序列（2）桥

54、式PCR将样品平铺到预制的含与接头序列互补的平板上（flow cell）,平板结构如下:Flow cell表面是寡聚引物加上接头的序列与平板上寡聚引物互补配对21 / 19Each cluster has a unique sequence每个簇都有约10000个拷贝，且每个簇都代表一个独特序列酶聚合形成双链桥式结构加上接头的序列与平板上寡聚引物互补配对，然后进行酶聚合反应 变性使原始模板链分离并洗净.! 模板链脱离单链弯曲杂交在相邻的引物上 单链弯曲杂交在相邻的引物（与另一端结合的引物）上。 酶聚合形成双链桥式结构；之后桥式结构打开形成的两个 copy又在其各自周 围形成新的copy。 桥式

55、双链分开，反向链（底3'-5'上）被切掉后洗脱（通过切反向链引物）；加入测序引物测序，如图右正向链3'端被封闭，防止不必要的DNA延伸8.高通量测序数据的分析流程其文件格式为fastaq高通量测序数据以程序读出的reads数据及对应的质量分值的格式保存,格式高通量测序最原始的数据为荧光信号，首先将荧光信号转化为序列信息，即reads数据及对应的质量分值。为了便于测序数据的发布以及共享，一般需要对数据进行格式转换，最常用的数据格式是fastaq。对于得到的数据必须对其质量进行评估，评估指标包括G*量，碱基质量，插入缺失错误，以便过滤掉质量差的reads。若数据质量评估过关，接着将原始reads map到基因组上。若无参考基因组，则需用de novo 组装方法。得到测序数据的组装图后，便可以根据实验目的， 对组装好的数据进行相关的分析。如分析基因的剪接位点，SNP&点，变异位点，还可以分析基因的差异化表达(DNA,RNA),转录因子结合位点(Chip-seq),甲基化模式(MeDIP-seq),同时还可利用此数据发现新的编码 基因和非编码基因。使用可视化软件对分析结果进行可视化处理。王秀杰老师部分：1想知道转录因子的结合位点用什么方法？转录调控是基因表达的关键步骤：转录调控因子(transcri