菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究_图文

1、广西大学硕士学位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究姓名：龙海荣申请学位级别：硕士专业：制糖工程指导教师：杨洋20090603菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究摘要黄酮类化合物是具有生物抗氧化性、抗衰老，治疗心血管疾病、降低胆固醇水平等多种保健功能的生物活性物质。菱角资源丰富，含有大量的生物活性物质，本文以四角野菱壳为原料，主要研究了菱角壳黄酮的提取工艺，纯化工艺，以及对得到的菱角壳黄酮产品进行初步鉴定，同时研究了菱角壳黄酮的抗氧化活性。主要实验结果如下：菱角壳黄酮提取工艺的优化。应用超声波辅助提取技术提取菱角壳黄酮具有省时、节能、高效等优点，应用价值较高。根据正交实验得出其最优提取

2、工艺条件为：甲醇浓度、提取时间分钟、料液比：、超声功率，在该条件下菱角壳黄酮的提取得率最高，为。菱角壳黄酮的纯化工艺研究。以聚酰胺粉纯化菱角壳黄酮效果最好，吸附量为干树脂，吸附率为，解吸率为，最佳吸附时间为小时。以上样液浓度，流速，分别用、的乙醇洗脱可有效分离菱角壳黄酮，分别得到样品、，总黄酮含量分别为、。经紫外光谱、高效液相色谱及红外光谱鉴定得出：样品为结构较简单的酚类化合物，样品、为没食子酸类化合物，样品为黄酮。菱角壳提取物的抗氧化活性研究。抗氧化实验显示菱角壳提取物是优良的抗氧化剂：菱角壳提取物的还原能力和清除自由基能力和相当，大于合成抗氧化剂，清除能力和提取物的总黄酮含量相关，总黄酮含

3、量越高则清除能力越强。在清除羟自由基实验中，菱角壳提取物的清除能力远大于和；而清除超氧阴离子自由基实验的结果显示提取物的清除率都超过，菱角壳提取物的清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力与提取物中的总酚含量相关，总酚含量越高则清除率越高。关键词：菱角壳黄酮提取工艺分离抗氧化，：，：，：，（），一，：仔；广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用

4、过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。：花撕曲夕年学位论文使用授权说明照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：务：多月节本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：妲靠口时发布口解密后发布（保密论文需注明，并在解密后遵守此规定）论文作者签名：商像翩签名：否月多严日广西大掌硕士学位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究第一章绪论几千年来，人类

5、主要依靠植物得以生存，无论是植物食物还是植物药，都为人类的繁衍生息作出了巨大的贡献，食物链中不可能没有植物的参与，目前临床上使用的药物中仍有直接或间接来源于植物【。植物是开发新药和保健食品的最重要原料，对植物活性成分的研究是植物药和保健食品领域的研究热点。菱角概述及研究现状菱角简介菱角是菱科植物的果实，中药大辞典所收录名为菱；在别录中收录名为菱、菱实、菱角。全国中草药汇编、长白山植物志、中国高级植物图鉴等文献中，均收录此植物。形态菱角【】，为菱科（）菱属（）一年生水生草本。叶二型，浮生叶聚生于茎顶部，成莲座状；叶柄中部膨胀成海绵质气囊，被柔毛；叶片三角形，边缘上半部有粗锯齿，近基部全缘上面绿色

6、无毛，下面脉上有毛。沉浸叶羽状细裂。花两性，白色，单生于叶腋；花萼深裂；花瓣；雄蕊；子房半下位，室，花柱钻状，柱头头状花盘鸡冠状。坚果倒三角形，两端有刺。花期月；果期月。分布卅菱角原产亚洲和欧洲的温暖地区，只有印度和中国进行了驯化和栽培利用。我国的浙江省多年前就已经有菱角栽培，它主要生长在湖泊浅水或池沼之中，适宜气候温暖的环境，不耐霜冻，但可在深水中生长，对生长的水域环境要求不严格。目前我国的菱角种植面积约公顷，年产量大约万吨，主要分布在湖网密集地区，如山广西大掌硕士学位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究东、江苏、湖南、湖北、浙江、广西、广东、云南和台湾省南部地区，朝鲜、日本、俄罗斯远

7、东地区也有分布。营养成分菱角的果肉为白色，味道甘甜，细腻，营养丰富，是我国重要的可食果资源。菱角的营养丰富，其主要的营养成分为：水分，脂肪，蛋白质，膳食纤维，碳水化合物，热能，同时菱角中还含有钙、磷、铁、胡萝素、硫胺素、核黄素、尼克酸和丰富的、。菱角中还含有种氨基酸，其中精氨酸、谷氨酸含量特别高，果肉中除苯丙氨酸、异亮氨酸外，其余的氨基酸含量普遍高于绞股蓝地下茎中氨基酸含量。菱角的果肉中含有种人体必需氨基酸，总含量为，远高于野山参的及西洋参的。由此看来菱角的营养成分含量丰富，种类齐全，比例协调，具有较高的营养保健和开发利用价值。食用和药用价值菱角食用和药用价值较高。齐民要术载，“菱芝中米，上品

8、药，食之安神补脏，养神强志，除百病，益精气，耳目聪明，轻身耐劳。蒸粮蜜和食之，长生似神仙。中药大词典载】，“菱肉可治一切腰腿筋骨疼痛，周身四肢不仁，风湿入壳之症”；菱叶可“擦小儿走马疳”和“小儿头症；菱壳可治腹泻、脱肛、痔疮、黄水症、天疱疮；菱茎可治胃溃疡及多发性疣赘；菱粉可补脾胃，强腰膝、健力益气、行水、去署、解毒。由于菱角食疗存在保健功效，医学家用它制成许多食疗滋补品，如鲜菱汁饮料、菱蜜茶、菱粉粥等。另据本草纲目载，菱另录水枣，风俗通沙角，用来安中补五脏，解丹毒；鲜者，解伤寒积热，止消渴，解酒毒、射罔毒；侯士良主编中药八百种详解载【】，菱性味：甘、淡、平；古今用来：清暑解热，用于夏季中暑、

9、烦躁口渴、伤寒积热、疟疾；除湿祛风，用于风湿痹痛、腰腿疼痛、周身四肢麻木不仁，全身泛发性湿疹、风疹等；益气健脾，用于脾胃虚弱、脘腹胀满、消化不良、声音低弱，甚至脱肛等；解酒毒，用于酒后烦渴；抗癌，用于食道癌、乳腺癌、宫颈癌等。菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究菱角国内外研究情况国外研究情况日本的系川秀治等人对种植物进行了抗肿瘤活性筛选，试样以蒸馏水、乙醇加热提取，用腹水肿瘤作总细胞容积法依据，实验结果表明，菱角的水提物抑瘤率为；菱角的醇提取物抑瘤率为。日本中田寿信等人从菱角中分离出谷甾醇，小官卓夫等人从菱角的果实中提取出没食子酸来代表其水浸膏的活性成分【】。在北美，菱角是外来入侵物种，生物

10、学家们主要进行的研究是如何防止它的入侵以及对水体的影响，而有关菱角的化学成分和活性物质方面的研究报道很少。国内研究情况近几年来，国内学者在前人的研究基础上，对菱角这种植物进行了更加系统与深入的研究。我国学者郭峻等【】做了带蒂菱壳水提物对大肠杆菌回复突变的抑制作用研究，结果说明该水提物使所致的相对突变活性下降到以下。张延岭等【】用山东平湖菱肉进行小鼠抑瘤实验及肝癌抑瘤实验，结果显示：对小鼠肉瘤的抑制率为，对小鼠肝癌的抑瘤率为。除菱角的抗癌活性外，学者们也对菱角淀粉进行了比较深入的研究。台湾研究了菱角在生长过程中淀粉的性质变化【】，得出菱角在成熟期前淀粉含量由上升到。湖南农大的李向红等】也对菱角淀

11、粉的理化性质进行了研究，得出菱角淀粉支链淀粉含量为。在菱角的生物活性物质方面，牛凤兰等人的研究小组【。】等对东北菱进行了较为系统的研究，对东北菱的质量标准，营养成分，抗肿瘤成分等进行了研究，得出没食子酸可能为东北菱的抗肿瘤成分，也对黄酮类化合物的初步研究，初步确定菱角中含有黄酮类化合物。尚庆坤等【，】对菱角中的生物碱和多糖类物质进行了研究，对菱角壳的生物碱进行分析得出水溶性生物碱占；对菱角壳中的多糖和单糖组成进行了确定。广西大学硕士学位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究黄酮类化合物概述】黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物，泛指两个具有羟基的苯环（和）通过中央三个碳

12、原子相互连结而成的具有骨架结构的结构的一系列化合物及衍生物。其母核为一苯基苯并吡喃酮（图）。一一苯基苯并吡喃酮图黄酮类化合物的基本结构根据中央三碳链的氧化程度，环（苯基）连接位置（位或位）以及碳链是否成环状等特点，可将黄酮类化合物分成黄酮类、黄酮醇类、双氢黄酮类、双氢黄酮醇类、异黄酮类、双氢异黄酮类、查尔酮类、双氢查尔酮类等几大类。黄酮类化合物的理化性质】理化特性黄酮类化合物大多为结晶性固体，少数的黄酮苷类为无定形粉末。游离的苷元母核中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷和黄烷醇有旋光活性以外，其余的都没有光学活性。黄酮苷类由于在结构中引入糖的分子，所以都有旋光性，且大多为左旋。黄酮类化合物是否有颜

13、色与分子中是否存在交叉共扼体系，助色团（，等）的种类、数目以及取代位置有关系。一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类显灰黄色或黄色，查尔酮为黄色或橙色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，因不具有交叉共扼体系或共轭链较短，一般没有颜色或显微黄色。菱角壳黄酮的提取、分离及执氧化活性研究溶解性黄酮类化合物的溶解度与其结构及存在的状态相关。一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中。其中黄酮、黄酮醇、查尔酮等平面性较强的分子，因分子与分子间的排列紧密，分子间引力较大，故难溶于水；而二氢黄酮及二氢黄酮醇等为非平面性分子，因而分子与分子间不紧密，分子间引力小，有利于水分

14、子的进入，因而溶解度稍大。黄酮类苷元分子中引入羟基，将增加在水中的溶解度；而羟基经甲基化后会增加在有机溶剂中的溶解度。黄酮类化合物的羟基糖苷化后，在水中的溶解度会加大，而在有机溶剂中的溶解度则会相应减小。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性的溶剂，但难溶于苯、氯仿等弱极性溶剂。黄酮苷结合的的糖链越长，其溶解度则越大，另外，糖苷基的结合位置不同，对溶解度也有一定的影响。酸碱性黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，因而显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶甲酰酸性强弱顺序为：，二或一般酚吡喃环上的氧原子，因为有未共用的电子对，故表现微弱的碱性，可与强的无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，遇水

15、即可分解。黄酮类化合物的提取与纯化方法提取方法（）热水提取法加热水提法可用浸提法也可用煮提法，一般提取到次，由于黄酮苷类物质易溶山楂进行回流提取，得到质量分数为的黄酮类物质。采用水提法工艺优点明胺以及二甲基甲酰胺中。由于酚羟基的取代位置不同，酸性强弱也不同。一般情况下的于水，因而该法常用来提取黄酮苷类含量较高的原料。苏刚等用。（热水浸泡显，成本低，工艺安全，适合工业化生产，但同时容易把糖类、无机盐、氨基酸等溶于水的成分提取出来【。（）碱性水或碱性稀醇提取法黄酮苷类物质有一定极性，溶于水，一般易溶于碱性水，难溶于酸性水，故可先用碱性水进行提取，再将碱性提取液调成酸性，黄酮苷类物质即可沉淀析出。碱

16、性提取时，所用碱的浓度不能过高，以免在强碱条件下加热会破坏黄酮类化合物的母核结构，加酸酸化时，酸性也不宜过强，否则易生成佯盐，致使析出的黄酮化合物又重新溶解，降低产品收率。一般可以根据原料不同而使用不同的碱性溶液，例如从菊花中提取黄酮类物质时，用为的溶液浸出效果较好【】。（）有机溶剂萃取法将干燥粉碎后的原料用其他方法进行粗提取后，用适当的有机溶剂（如乙酸乙酯、石油醚、正丁醇等）进行萃取、过滤，滤液中的溶剂减压蒸馏回收，然后得到产品。这是目前国内外使用较广泛的提取方法，该法投资少，设备简单，产品的得率高，但同时产品中的杂质含量也较高。乙醇和甲醇是提取黄酮类化合物的最常用溶剂，高浓度的醇一般适合提

17、取苷元，左右的醇适合提取苷类。胡福良等【】提取蜂胶液中黄酮类化合物，得出的结论为乙醇提取的总黄酮含量最高。（）酶解法酶解法是指在黄酮提取过程中，通过加入适当的酶发生酶解反应而使产品类黄酮得率和含量大大提高，对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料可以采用该法。孟志芬等【用酶法提取香椿叶中的黄酮，其提取率较高，并且能避免大量有机溶剂的使用。（）超滤法当溶液中含有两种或两种以上溶质时，通过滤膜分离流动时，其中分子体积小的溶质，可以经滤膜流出，而分子体积较大的溶质，因不能通过滤膜而被截留，这就是超滤法的工作原理。黄酮类化合物的分子量多在以下，而多糖、蛋白质等物质的分子量多在以上，因而可使用超滤法

18、除去这些杂质，提高药液澄清度和有效成分含量，而且在分离过程中无相变，有效成分理化性能稳定，结果重复性好，准确性高。张效林等【用超滤法法提取侧柏叶总黄酮时，有效地分开了鞣质和脂溶性叶绿素等杂质成分，结果令人满意。（）超声波辅助提取法超声波法是利用超声波的空化作用来破坏植物的细胞结构，使溶剂易于渗入细胞内部。同时超声波的强烈振动能给植物原料和溶剂传递巨大的能量，使它们做高速的运动，加速细胞内物质的释放和溶解以及有效成分的浸出，大大提高了提取效率。阳文斌掣】采用超声波法提取花生壳中总黄酮，其纯度和产率均较高。刘海鹏掣”】用超声波提取银杏叶总黄酮比回流法提取率高，总黄酮提取率达。霍丹群等【】在综合考虑

19、工艺成本和工艺可行性条件下，采用超声提取法提取山楂黄酮，提取时间大大缩短，产率较高，并且实验可在室温下进行，设备简单，操作方便。（）微波辅助提取法本法多用在药材的浸出上，它的原理是利用磁控管所产生的每秒数亿次超高频率的快速振动，使药材内分子间相互碰撞挤压，促使药材有效成分的快速浸出。在有效成分浸出过程中，药材的原料细粉不糊化也不易产生凝聚，克服了热水提取时易凝聚糊化的不足【】。等证实了微波法的方便快速性。吴雪辉等【】采用微波萃取技术提取板栗花提取率很高。刘峙嵘等【】采用微波法提取银杏叶中黄酮类化合物，与传统的乙醇水溶液法提取效果进行对照，传统的抽提时间为，而微波辐射后，只需要抽提就可达到效果。

20、利用微波处理的提取率是用传统方法提取率的倍，微波法萃取黄酮类化合物省时、提取率高，是一种有发展前景的新工艺。（）超临界流体提取法超临界流体提取法（，）是以超临界流体（，）为萃取剂，其中最为常用。在高压超临界状态下，以液态作抽提溶剂进行抽提，然后减压分离，随着压力下降，液态不断气化，从而分离出所需要的提取物【。方法具有提取效率高、无溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点，同时还可以通过控制临界温度和压力的变化达到选择性提取和分离化合物的目的【。广西大学硕士掌位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究黄酮类化合物的纯化方法【，】黄酮类化合物的分离纯化方法很多，有柱层析、薄

21、层层析、铅盐沉淀、硼酸络合、梯度洗脱以及近年来应用的高效液相制各色谱和高速逆流色谱（）等，但这些都因存在不同程度的缺点而限制了其工业化生产。由于黄酮类化合物的结构和性质不同，其分离纯化的方法也不同：极性大小不同，可利用吸附能力或分配原理进行分离；酸性强弱不同，可利用梯度萃取法进行分离；分子大小不同，可利用葡聚糖凝胶的分子筛作用进行分离；分子中某些特殊结构，则可利用与金属盐络合能力的不同进行分离。柱层析是最常用的分离方法，因为其使用较简易，而受到广泛的应用。常用的柱层析填充物有：（）硅胶非极性和极性化合物都能用，应用最广适于分离黄酮类、黄酮醇类、双氢黄酮类、双氢黄酮醇类、异黄酮类和黄酮苷元类。在

22、利用硅胶柱色谱对黄酮类化合物进行纯化时，选择合适的洗脱剂是关键，各种洗脱剂的洗脱能力如下：石油醚四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯吡啶丙酮正丙醇乙醇甲醇水。（）活性炭活性炭来源容易，价格便宜，在水中吸附力大，在有机溶剂中吸附力小，对大分子化合物的吸附力大于对小分子化合物的吸附力。活性炭吸附法主要用于苷类的纯化。（）离子交换树脂离子交换法对黄酮类化合物的提取、分离、纯化可一步完成，可除去黄酮类化合物中的水溶性杂质。先用阴（或阳）离子交换树脂吸附黄酮，然后用水洗涤柱子，把水溶性杂质除去，再用醇溶液把黄酮类化合物依次洗脱下来。（）大孔吸附树脂大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，是在离子

23、交换剂广西大学硕士学位论文菱角壳。黄。酮的提取、分离及抗氧，化活性研究和其它吸附剂应用基础上发展起来的一类新型树脂。吸附树脂因为树脂能够对物质进行有选择性地吸附因而能够用于物质的分离纯化。这种吸附作用是吸附质与吸附剂即吸附树脂之间的作用力产生的。吸附树脂对物质的这种作用力可分为氢键力、定向力、诱导力和色散力。吸附树脂的吸附特性主要取决于树脂的化学性质、比表面积和孔径。按照树脂的表面性质分类，一般分为非极性、中极性和极性三类。非极性树脂是由偶极矩很小的单体聚合制得的，不带任何功能基的吸附树脂，这类吸附树脂孔表面的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分相互作用吸附溶液中的有机物，最适于由极性溶剂中

24、吸附非极性物质。中极性吸附树脂是含酯基的吸附树脂，其表面疏水部分和亲水性部分共存，因此，既可用于极性溶剂中吸附非极性物质，又可用于由非极性溶剂中吸附极性物质。极性吸附树脂是指含有酰胺基、氰基、酚羟基等极性功能基的吸附树脂，该类树脂最适用于由非极性体系里分离极性物质。（）聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类大分子化合物。聚酰胺既有半化学吸附即氢键吸附色谱的性质，又有分配色谱的性质，属于双重色谱吸附剂。聚酰胺是分离黄酮类化合物理想的吸附剂，且其层析容量大，适用于制备性分离，可以将植物粗提物中的黄酮与非黄酮体、黄酮体苷元与苷分开。若采用含水溶剂系统（如：乙醇一水），非黄酮体水溶性成份及少数黄酮体苷可用

25、水冲洗下来。大多数黄酮体苷在，醇液中洗脱下来。黄酮体苷元的混合物用非极性溶剂系统分离较好。洗脱溶剂从高极性至低极性，以达到分离的目的。聚酰胺的层析原理主要是氢键吸附，聚酰胺的吸附作用是通过其酰胺羰基与黄酮化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合产生的，因此吸附作用的强弱取决于黄酮分子中酚羟基数目与位置以及洗脱溶剂的性质。溶剂系统常用不同比例的乙醇水来分离苷和高度羟基化的黄酮。（）葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是具有许多孔隙的网状结构的固体，具有分子筛的性质。分离游离黄酮时，主要依靠吸附作用，吸附强弱取决于含羟基的数目。分离黄酮苷时，则取决于分子筛属性，洗脱时黄酮苷按分子量由大到小依次流出。广西大掌硕士学位论文菱

26、角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究抗氧化剂抗氧化能力的评价方法随着生物抗氧化剂和天然抗氧化剂研究的不断深入，对抗氧化剂的抗氧化能力评价方法也在不断的发展完善。目前，国内外测定抗氧化剂抗氧化能力的方法可以说是多种多样，但还缺乏一个科学完整的评价体系，主要包括体内和体外评价两大类。抗氧化剂的体内测定评价方法主要有低密度脂蛋刍（）氧化分析法、动物试验、生物体系中脂质过氧化检测法、人体血清中抗氧化能力与某种疾病相关的流行病学调查等，氧化分析法是从健康成人的血液中分离出，再利用过渡金属离子（如）催化氧化修饰，加入抗氧化剂可抑制其氧化修饰的原理来评价受试物的抗氧化活性。脂质过氧化检测法，主要是用硫代巴比

27、妥酸法，通过测定血清或肝等组织匀浆中的脂质过氧化物丙二醛（）的量来反映抗氧化剂抑制脂质过氧化的能力【。抗氧化的体外测定方法非常多，它是食品天然抗氧化剂筛选和研究的重要步骤，总的说来又可分为物理方法和化学方法。物理方法应用较多的是电子顺磁共振（，）法，这是检测自由基最直接最有效的方法，它是根据自由基含有一个未成对电子，具有顺磁性和很高的反应活性，通过波谱仪来测定，此法优点明显，检测迅速准确，但同时缺点也十分明显，仪器设备较贵，不宜推广。化学方法主要有（油脂过氧化值）法和比色法等【，。法是利用抗氧化剂抑制油脂氧化的能力不同来比较抗氧化能力的强弱的试验，通过测定油脂过氧化值的变化，来反映抗氧化剂的活

28、性。比色法主要是依据抗氧化剂对自由基具有捕获能力或对氧化剂具有还原能力的原理，当抗氧化剂或各种植物的提取液加入到人工合成的自由基或氧化剂中后，其在最大吸收波长处的吸光度将下降，而抗氧化能力与吸光度下降值之间呈线性相关关系后，可用分光光度计进行定性定量分析。对于不同的抗氧化剂，其抗氧化能力可根据清除原始自由基所用的抗氧化剂量（半效浓度，）的大小来比较，越小则抗氧化剂的抗氧化能力越耐。以下是几种常见的抗氧化能力体外评价方法。清除自由基法清除（，二苯基一苦肼基自由基）法是近年来国内外普遍使用的一种研究抗氧化剂的方法【】，它具有快速、简便、灵敏、易检测和直接可行的优点【，被广泛用于菱角壳黄酮的提取、分

29、离及抗氧化活性研究抗氧化剂的研究。自由基溶于有机溶剂【，是一种稳定的质子自由基。它的稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍，使夹在其中氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。自由基因为具有单电子而在紫外光谱中处有强吸收，呈深紫色，当有自由基清除剂存在时，由于其单电子配对而使特征吸收逐渐消失，褪色程度与其接受的电子数呈定量关系。该自由基对光、强酸、强碱较为敏感，在强酸、强碱条件下能迅速失效，溶剂（水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿）的影响不大，因此试验应尽量在避光、酸碱性温和的条件下进行。抗氧化能力越强，吸光度值下降越大，溶液的颜色越淡。清除羟自由基实验利用和混合发生反应，生

30、成具有很高反应活性的，在体系内加人水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在下有最大吸收。但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。因而可以利用吸光度值的变化来反映样品清除羟自由基的能力【。清除超氧自由基实验生物体内氧化还原反应中，大约有的氧会产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，表现在使核酸链断裂、多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化作用，进而造成遗传突变、酶系失活、膜损伤、线粒体氧化磷酸化作用改变等一系列变化。】。超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，具有很强的氧化能力，因此在检验抗氧化物质的活性时经常把清除超氧阴离子自

31、由基作为其中一个重要的指标。产生超氧阴离子自由基的体系有多种，其中邻苯三酚自氧化法所用试剂廉价，操作简单快捷，是最为常用的方法。还原能力研究表明，抗氧化剂的还原力与其抗氧化性之间存在联系【。还原能力是从提供电子能力的角度来检测物质的抗氧化性，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子【。在反应中，抗氧化剂提供的电子，能够中断自动氧化成氢过氧化物的链锁反应，这样就可以广西大学硕士掌位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究表现出该物质的还原能力。测定还原能力实验中常以作为氧化剂，将还原为，颜色由黄色变为蓝绿色，在紫外光谱中处有强吸收。吸光值越大，表明还原能力越强，抗氧化性越吲。测定抗氧化能力的方法有很

32、多种，由于测定过程受多种因素的影响，可能会造成测定结果不一致，因此对生物抗氧化剂抗氧化能力的评价应从多个方面展开，进行综合评价。选题依据大量的实验研究表明黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗菌消炎、降血糖、抗病毒、抗肿瘤和护胃保肝等功效。目前黄酮主要从银杏叶、大豆、沙棘等植物中提取分离，文献报道称所有的植物中都含有黄酮类物质【。菱角是我国传统的水生经济作物，种植分布较广，产量较大。有关菱壳中黄酮类化合物及其相关活性研究的文献报道很少。本文采用廉价且来源较为丰富的菱角壳作为原料，提取其中的黄酮类物质，探讨菱壳黄酮存在形式和总含量，并研究其抗氧化性能，为综合利用菱角资源提供一条有效途径。研究内容（）

33、利用超声波醇提法对菱壳黄酮进行提取分离，并对提取工艺进行优化。（）对菱壳中总黄酮的含量进行测定。（）利用柱色谱法采用几种不同的树脂对菱角壳黄酮进行纯化研究，优选出最适的树脂和最佳的纯化工艺。（）采用颜色反应、紫外光谱、红外光谱、和高效液相色谱法对菱角壳的纯化物进行初步鉴定。（）采用不同的体外模型对菱角壳黄酮提取物进行抗氧化活性研究。菱，角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究第二章菱角壳黄酮的提取工艺研究材料、试剂与仪器实验材料与试剂原料：菱角壳（四角野菱，产地：山东微山湖）试剂：乙醇、石油醚（）、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝、锌粉、氢氧化钠、乙酸钾（均为分析纯）；芦丁标

34、准品（纯度）为公司产品。主要实验仪器设备型超声波破碎仪美国公司上海亚荣生化仪器厂上海实验仪器厂有限公司特勒托利多仪器有限公司国华电器有限公司旋转蒸发器电热鼓风干燥箱电子天平数显恒温水浴锅型循环水式多用真空泵型微型螺旋混合仪型离心机型台式恒温振荡器脱色摇床型分光光度计郑州长城科公贸有限公司上海沪西分析仪器厂北京京立离心机有限公司上海跃进医疗器械厂江苏海门麒麟医用仪器岛津（）公司天津市泰斯特仪器有限公司上海岑达天平称有限公司型中草药粉碎机金马牌一架盘天平广西大掌硕士掌位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究实验方法总黄酮含量的测定方法：（）比色法【黄酮类物质在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下，可与硝

35、酸铝生成黄色的黄酮铝络合物，在碱性环境下显红色，在可见区能获得稳定的特征吸收峰。菱角壳提取物中总黄酮含量的测定采用（）比色法，以芦丁为标准对照品，在波长处测定吸光度值，对照芦丁标准曲线，计算提取物中总黄酮的含量。溶液的配制芦丁标准品于干燥至恒重后，精密称取，用甲醇溶解后移入容量瓶中并用乙醇定容至刻度，摇匀，制备成浓度为的标准品溶液备用。溶液：精确称取，加入蒸馏水，使其充分溶解后转移至容量瓶中备用。（）溶液：精确称取（），加入蒸馏水，使其充分溶解后转移至容量瓶中备用。：准确称取固体，溶解并移入容量瓶，定容至刻度备用。标准曲线的绘制准确移取配制好的芦丁标准液、于具塞试管中，用甲醇补充至约，摇匀；加

36、入溶液，摇匀放置后，加入（）溶液，后，加入溶液，用甲醇定容至刻度，摇匀，后，以试剂空白为参比，于处测吸光度值。用最乘法线性回归，得出芦丁含量（）与溶液吸光度之间的回归方程。样品中总黄酮含量的测定准确移取样品于具塞试管中，用甲醇补充至约，摇匀；加入广西大掌硕士掌位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究溶液，摇匀放置后，加入（）溶液，后，加入溶液，用甲醇定容至刻度，摇匀，后，以试剂空白为参比，于处测吸光度值。根据标准曲线计算样品总黄酮含量。样品重复测定试验分别取一提取液样品按照方法进行重复测定六次，记录吸光度值。此试验用于评价测定方法的重现性和可靠性。加样回收率试验取已测定浓度为的样品，按照一

37、定比例加入含量为的标准品，再进行检测得出总黄酮含量。加样回收率的计算方法为：加样回收率：×本实验采用的加样回收率测定方法是向已知含量的样品中加入、的芦丁标准品，按含量测定的方法测定，分三组，做三个平行，计算平均回收率与实验的相对标准偏差。显色稳定性试验在实验过程中，显色时间的长短对样品的吸光度影响较大，因此有必要对测定方法的显色稳定性进行试验，找到适合的显色时间。取同一浓度样品溶液按照方法，自加入氢氧化钠溶液之后每间隔分钟测一次吸光度值。菱角壳总黄酮的提取工艺研究原料预处理选取新鲜无霉烂的野生小四角菱，去除果肉，将菱角壳清洗后置于。烘箱中烘干，用药物粉碎机粉碎，过目筛后得菱角壳粉备用

38、。脂溶性物质会对检测结果产生影响，有必要进行脱脂。称取上述菱角壳粉加入石油醚（），超声处理小时，抽虑；重复次，挥干石油醚，得到的脱脂样品作为后续提取工艺试验的样品。提取溶剂的选择准确称取菱角壳粉份各，于三角瓶中，分别用水、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇为溶剂，以料液比比：，使用超声波破碎仪功率档，提取分钟，抽虑，将滤液定容至容量瓶，按照方法进行总黄酮含量的测定。根据测定结果，综合各种影响因素，以选取合适的溶剂作为菱角壳黄酮的提取溶剂。单因素实验甲醇浓度对提取得率的影响准确称取菱角壳粉份各，于三角瓶中，分别用、浓度的甲醇水溶液作为提取溶剂，以：的料液比，使用超声波破碎仪功率档，超声提取分钟

39、，处理结束后迅速抽虑，滤液定容至容量瓶中，待测。每组平行三次确定出最优的提取浓度。时间对提取得率的影响准确称取菱角壳粉份各，于三角瓶中，以的甲醇作为提取溶剂，以：的料液比，使用超声波破碎仪功率档，分别超声提取、，处理结束后迅速抽虑，滤液定容至容量瓶中，待测。每组平行三次，确定出最优的提取时间。料液比对提取得率的影响准确称取菱角壳粉份各，于三角瓶中，以的甲醇作为提取溶剂，使用超声波破碎仪功率档，超声波提取，考察不同料液比：、：、：、：、：对提取得率的影响，处理结束后迅速抽虑，滤液定容至容量瓶中，待测。每组平行三次，确定出最优的提取料液比。功率对提取得率的影响准确称取菱角壳粉份各，于三角瓶中，以甲

40、醇作为提取溶剂，以：的料液比，超声提取分钟，分别考察用超声波破碎仪的五个功率档对提取得率的影响（选用的型超声波破碎仪最大功率为，功率可调范围为一，含五个功率档位），处理结束后迅速抽虑，滤液定容至容量瓶中，待测。每组平行三次确定出最优的提取功率。正交试验按照单因素实验结果，设计四因素三水平（）正交表，以优选最佳提取工艺。结果与分析总黄酮含量的测定方法：（）比色法芦丁标准曲线的绘制以方法绘制标准曲线，记录的实验数据见表表芦丁含量与对应的吸光度以吸光度为横坐标，芦丁含量为纵坐标，绘制标准曲线，如图所示。用最小二乘法进行线性回归分析得回归方程为：式中：一芦丁含量（）；一吸光度值，。为，在浓度范围内具有

41、良好的线性相关性。广西大学硕士掌位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究样品中总黄酮含量计算公式：丁：（）图一标准曲线图×样品的总黄酮得率计算公式：（面万五丽一）式中：×样品中总黄酮的含量（），以芦丁计；样品的总黄酮提取得率；样品溶液的吸光度；一样液总体积，；测定时取样体积，；样品质量，。样品重复测定试验取一提取液，按照方法测定，重复次。测定结果见表。结果表明所用的菱角壳总黄酮含量的测定方法具有较高的可靠性和重现性。表样品重复测定试验结果广西大学硕士学位论文菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究样品回收率试验分别在已测含量的样品液中添加一定比例的标准品芦丁进行回收率试验

42、。实验结果见表实验结果显示平均回收率为，为。结论：所用的菱角壳总黄酮含量的测定方法准确度高。表加样回收率试验结果显色稳定性试验实验中发现样品测定过程中吸光度值随时间的增加会产生波动，因此对测定方法的显色稳定性进行试验。图显色稳定性曲线以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制显色稳定性曲线图，如图。结果表明：在添加氢氧化钠之后的时间范围内，吸光度值比较稳定，因此在加入氢氧化菱角壳黄酮的提取、分离及抗氧化活性研究钠后的内测定结果比较准确。菱角壳黄酮的提取工艺研究提取溶剂的选择黄酮类化合物的结构和来源一般不同，因而溶解性差别较大，应依据极性和水溶性选择合适的溶剂进行提取。目前，对苷类和极性较大的苷元常用一些极性较强的溶剂如水、甲醇、乙醇