荧光定量PCR检测HBV-DNA与乙肝两对半检测结果的相关性探讨

1、荧光定量PCR检测HBV-DNA与乙肝两对半检测结果的相关性探讨    摘要：目的：探讨HBV-DNA的检出情况与乙肝两对半结果之间的关系。方法：运用荧光定量PCR（FQ-PCR）检测307例疑似乙肝患者血清中的HBV-DNA，同时运用ELISA方法进行两对半指标的检测，并对结果进行相关性探讨。结果：HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+     张蓓， 杨晓云， 刘蕊， 纪凤祥 摘要：目的：探讨HBV-DNA的检出情况与乙肝两对半结果之间的关系。方法：运用荧光定量PCR（FQ-PCR）检测307例疑似乙肝

2、患者血清中的HBV-DNA，同时运用ELISA方法进行两对半指标的检测，并对结果进行相关性探讨。结果：HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)组（大三阳组）患者血清HBV-DNA检出率为98.15%（53/54），平均拷贝数为7.56E+06/ml；HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)组（小三阳组）患者血清HBV-DNA检出率为27.78%（15/54），平均拷贝数为3.79E+05/ml；HBsAg(+)HBcAb(+)组血清HBV-DNA检出率为91.18%（31/34），平均拷贝数为2.85E+05/ml，小三阳组HBV-DNA阳性检出率及拷贝数均低于大三阳组，且与大

3、三阳组比较均具有显著性差异（P<0.01，P<0.05）；HBsAb()组血清HBV-DNA检出率为1.6%(1/63)，平均拷贝数为1.13E+08/ml ；HBcAb(+) 组血清HBV-DNA检出率为16.67%(1/6)，平均拷贝数为3.00E+04/ml；HBsAb() HBeAb()HBcAb()组血清HBV -DNA检出率为12.50%(4/32)，平均拷贝数为3.00E+05/ml；HBsAg(+)组血清HBV-DNA检出率为0（0/2）；HBV-M全阴性组HBV-DNA检出率为1.61%（1/62），平均拷贝数为2.75E+05/ml。结论：HBV-M阴性患者仍有

4、HBV-DNA阳性者，因此在检测中应联合应用两种方法进行检测，提高检出率，避免漏诊，为临床HBV感染、复制及传染性的判断以及指导治疗提供更为可靠的判定依据。   关键词：  常规检查；  HBV-DNA；  荧光定量PCR   Correlation of Detection of HBV-DNA by Fluorescent Quantitative PCR with Routine Detection of HBV   ZHANG Bei，  YANG Xiao-yun，  LIU Rui，  et

5、al   (Tianjin People's Hospital, Tianjin 300121，China)   Abstract：Objective：To explore the relationship between detection of HBV-DNA and routine detection of HBV.Method：HBV-DNA was detected with fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) and HBV was routinely determined with ELISA in serum

6、samples from 307 suspected cases of hepatitis B.Meanwhile ,the correlation of results between the two methods was analyzed.Result：The detecting rate of HBV-DNA was 98.15% (53/54) and the mean copy number was 7.56E+06/ml in patients of  HBsAg(+),HBeAg(+) and HBcAb(+) (group A), 27.78%（15/54）and

7、3.79E+05/ml in patients of HBsAg(+),HBeAb(+) and HBcAb(+) (group B), 91.18%（31/34）and 2.85E+05/ml in patients of  HBsAg(+) and HBcAb(+) (group C).The 2 parameters were significantly lower in group B than in group A(P<0.01 and 0.05).Furthermore,they were respectively 1.6%(1/63) and 1.13E+08/m

8、l in patients of HBsAb(), 16.67%(1/6) and 3.00E+04/ml in patients of  HBcAb(+),12.50%(4/32) and 3.00E+05/ml in patients of HBsAb(), HBeAb() and HBcAb(),0(0/2) in patients of HBsAg(+) and 1.61%（1/62）and 2.75E+05/ml in HBV-M- negative patients.Conclusion：HBV-DNA positivity may appear in HBV-M- ne

9、gative patients.Therefore,the 2 methods should be simultaneously used in the detection of HBV infection to promote the detecting rate to provide more reliable evidence for judgment of HBV infection,duplication and infectivity and its treatment in clinical practice.   Key words：  Routine de

10、tection;  HBV-DNA;  Fluorescent quantitative PCR   乙型肝炎是世界上最常见的传染病之一，世界卫生组织(WHO)估计，本病每年造成100万人死亡1。慢性乙型肝炎是HBV感染的一种严重后果。HBV-DNA是直接反映乙肝病毒存在、活动性复制及具有传染性的可靠指标2。但目前我国现状HBV感染者多以其血清感染标志物（乙肝两对半，HBV-M）判定，由于其组合模式复杂多样，从而导致了临床上对部分发病患者的HBV感染复制状况难以判断，有时甚至会出现漏诊的情况。定量PCR法的应用，使得我们进行HBV-DNA的检测的同时得以对其进行相

11、对的量化，这对于乙肝患者体内的HBV的复制以及传染性有更直接的了解，同时也更有利于对临床HBV感染的诊断、治疗方案的选择及疗效的判断。本文采用荧光定量PCR(FQ-PCR)对307例疑似乙肝患者标本血清的不同HBV血清学标志物组合进行了HBV-DNA检测，并对结果进行了统计学处理，以探讨HBV-M与HBV-DNA复制水平的关系，现报告如下：   1  资料与方法   1.1  标本来源：均系2004年7月至2005年8月到我院就诊的所有同时做过乙肝两对半及HBV-DNA检测的疑似乙肝的门诊和住院患者，共307例，其中女129人，男178人，年龄1778岁

12、，平均39岁。   1.2  检测仪器   1.2.1  LightCycler定量扩增仪（德国）。   1.2.2  Alisei全自动酶标仪（德国）。   1.3  检测方法和试剂   1.3.1  HBV-M检测：用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测，试剂由上海荣盛生物技术有限公司提供，并严格按说明书操作。   1.3.2  HBV-DNA定量分析：采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测，试剂由上海复星医学科技发展有限公司提供，严格按说明书的步骤进行操作。 

13、0; 1.4  统计学处理：根据HBV血清标志物分为8组，将各组的HBV-DNA拷贝数进行对数变换，以指数表示(±S)，定量测量范围仍用实际检测值表示；采用X2检验进行组间HBV-DNA阳性率显著性检验，采用两样本均数的t检验比较拷贝数。   2  结果   2.1  HBV-DNA定量测定结果：307例疑似乙肝患者血清标本中，106例HBV-DNA阳性，201例阴性，阳性最低拷贝数为1.30E+03copy/ml，最高拷贝数为7.70E+09copy/ml。   2.2  HBV-DNA定量测定与HBV-M的关系

14、，见表1。   表1  ELISA法检测HBV-M和荧光定量PCR检测HBV-DNA结果（略）   注：*与大三阳组比较P<0.01，#与大三阳组比较P<0.05   3  讨论   FQ-PCR是进行临床基因诊断的有效手段，它采用了完全闭管检测，不需要PCR后处理，避免了交叉感染；同时采用实时检测技术，所得Ct值和原始模板数量完全呈线形相关，定量准确率极高3，它不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光

15、谱的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点4。 ELISA法检测乙肝两对半是临床诊断HBV感染的传统手段，它检测的是人体对HBV的免疫反应状态，而FQ-PCR则可以准确的反应出HBV-DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。本文结果显示，54例大三阳组中，其HBV-DNA阳性53例，检出率达98.15%，而且呈较高的拷贝量，经统计学处理大三阳组和HBsAg(+)HBcAb(+)组与小三阳组有显著性差异，说明这些患者HBV具有较高的复制水平，是具有传染性的重要标志。     54例小三阳血清中15例检出HBV-DNA阳性，检出率为27.78%，平均拷贝数达到3.7

16、9E+05拷贝数/ml，虽然其拷贝数和阳性率均低于大三阳组，但仍然具有较强的传染性，说明HBeAb的存在并不表示患者体内没有病毒复制，与既往文献报道结果吻合。 在34例HBsAg(+)HBcAb(+)血清中，有31例检出HBV-DNA阳性，检出率为91.18%,平均拷贝数为2.85E+05/ml，提示该组中的病人仍具有较强的病毒复制，传染性强，此情况可能为血清转换期或前C区突变，如果经过动态观察，仍表现HBsAg(+)HBcAb(+)及HBV-DNA阳性，可能为前C区突变5。 在63例HBsAb(+)血清中，仍检测出1例HBV-DNA阳性，检出率为1.6%，平均拷贝数为1.13E+08拷贝数/

17、ml，6例HBcAb(+)血清中1例检出HBV-DNA阳性，检出率为16.67%，平均拷贝数3.00E+04拷贝数/ml，说明HBsAb产生和HBeAg转阴并不意味着病毒的复制停止或减弱。有学者认为此现象有可能与HBV-DNA前C区发生突变有关，出现“免疫逃逸”或不同亚型的HBV重叠感染6。也有学者证明乙型肝炎HBsAb出现后，血清内仍有DNA复制，随着时间的推移HBV-DNA的检出率逐渐下降7，8。 62例乙肝两对半全阴性的病人中仍有1例HBV-DNA阳性，平均拷贝数为2.75E+05拷贝数/ml，阳性率为1.61%，据国内外文献报道证实HBV-DNA的出现早于其他血清标志物，因此该l例受检

18、者可能处于早期感染9。乙肝两对半标志物全阴性的病人不能排除HBV感染。因此PCR的高灵敏度可作为早期诊断HBV感染提供依据，提示在临床上对HBV-M均阴性者，有进一步进行HBV-DNA、FQ-PCR检测的必要，以确立有无HBV感染。   综上所述，本研究结果表明，PCR与ELISA两种方法检测HBV感染与复制，多种血清学标志物模式都有一定的HBV-DNA检出率，由于DNA阳性表示HBV在体内复制，如果仅以HBV-M的检测结果作为判断HBV-DNA感染、传染性以及HBV是否在体内复制有一定的局限性，因此，为临床提供HBV感染、复制及传染性判断以及指导治疗和观察疗效，我们应选择乙肝两对半

19、标志物并同时做HBV-DNA的荧光定量PCR检测。   参考文献：   l  Davey S.State of the Worlds Vaccines and Immunization.Geneva:World Health Organization,199676.   2  彭文伟,主编.病毒性肝炎研究M.广州:广东科技出版社,19983.   3  程刚,何蕴韶,周新宇.荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒J.中华医学检验杂志,1999,22(3):135.   4  孙静,陈曲渡,张林林,等.乙肝标志物模式与HBV-DNA定量的分析比较J.现代中西医结合杂志,2002,11(8):750.   5  Rodriguez FF,et al.Hepatitis virus infection:precore mutants and its relation to vi