脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性的免疫组织化学研究

1、    脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障通透性 的免疫组织化学研究        摘要目的：研究脑缺血再灌注后大鼠血脑屏障（BBB）通透性改变。方法：采用线栓法大鼠大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型，缺血1 h后再灌注，分别于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、及24 h，采用免疫组织化学SABC法，观察内源性免疫球蛋白G（IgG）在脑组织中的表达。结果：再灌注0 h、3 h时，脑组织中未见IgG的表达。再灌注5 h时，缺血侧大脑半球纹状体有局灶性的IgG表达。再灌注

2、12 h 时，缺血侧纹状体及新皮层可见有广泛的IgG的表达。再灌注24 h时，表达更加明显。结论：缺血1 h再灌注35 h时，BBB开始受损开放，通透性增加。纹状体的BBB较新皮层更易受损。再灌注12 h、24 h，外渗的血清蛋白累积增加。主题词血脑屏障；脑缺血；再灌注；免疫组织化学中分类号R392.32文献标识码A文章编号1000-4718(2000)08-0755-02MeSH Blood-brain barrier; Cerebral ischemia; Reperfusion; Immunohistochemistry 脑水肿是脑缺血后主要的病理变化之一。脑缺血再灌注过程中亦可发生严重

3、的脑水肿。缺血引起的脑水肿包括细胞毒性水肿和血管源性水肿，后者是由于BBB受损，通透性增加，血清蛋白外渗所致。可见，研究BBB通透性对血管源性脑水肿的防治具有重要意义。目前，对脑缺血超早期再灌注后BBB通透性的研究，国内外的报道甚少。我们采用免疫组织化学的方法对大鼠局灶性脑缺血1h再灌注后不同时期的BBB通透性进行研究。材料和方法一、实验动物分组健康雄性Wistar 大鼠42只，体重为250350 g,由同济医科大学实验动物中心提供。随机分为脑缺血1 h再灌注0 h组、3 h组、5 h组、12 h组、24 h组及假手术组，每组7只大鼠。二、脑缺血再灌注动物模型的复制：参照Nagasawa等1的

4、方法并进行改动。大鼠用10%水合氯醛麻醉（35 mg/100 g体重ip），颈正中切开，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉，结扎ECA近端，结扎CCA，在近CCA与ECA交叉处剪一小口，插入栓线（栓线是4-0尼龙线，其头端5 mm涂有固体石蜡，直径为0.26 mm），缓慢向ICA插入，插入深度为1721 mm，在ICA根部结扎。从ICA抽出栓线即可造成再灌注。假手术组只结扎左侧的ICA、ECA，不插栓线。三、 组织切片的制备分别于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、24 h，再次麻醉大鼠，经升主动脉灌注4多聚甲醛（用磷酸缓冲液，pH7.4配制），取脑，于上述固定液内

5、后固定24 h 。常规酒精系列脱水、二甲苯透明、浸蜡和石蜡包埋。切成4 m厚的石蜡切片。四、 免疫组织化学染色以免疫组织化学SABC法对切片标本进行染色。生物素化羊抗大鼠IgG及SABC Kit 均购自武汉Boster生物工程有限公司。生物素化羊抗大鼠IgG使用效价为1100，染色步骤按说明书进行，设立替代对照试验。五、 免疫组织化学染色分级标准参照Akiguchi等2的方法进行分级。0级：未见染色；1 级：神经纤维网可见染色；2级：神经纤维网及120个神经细胞或神经胶质细胞胞体有染色（×200）；3级：神经纤维网及多于20个神经细胞或胶质细胞胞体有染色（×200）。对每组

6、大鼠脑片的缺血侧均匀地观察7个视野进行分级评分，取其平均值。六、 数据分析方法数据以±s表示，组间均数差异显著性采用t检验判定。结果一、 免疫组织化学染色假手术组、再灌注0 h组及再灌注3 h组脑组织中未见有IgG的表达。再灌注5 h组缺血侧纹状体可见有局灶性的IgG表达，神经纤维网呈棕褐色染色，神经细胞的胞浆内未见染色。再灌注12 h组和24 h组在缺血侧纹状体及新皮层有广泛的IgG表达，神经纤维网有更加明显的染色，众多的神经细胞和胶质细胞的胞浆内可见颗粒状棕褐色染色。再灌注24 h组比12 h组更加明显。二、 IgG染色分级评分结果分析再灌注5 h组IgG染色分级评分与再灌注0

7、h、3 h及假手术组相比具有显著差异（P0.05）。再灌注12 h组、24 h组与再灌注0 h、3 h及假手术组相比有非常显著差异（P0.01）。再灌注12 h组、24 h组与再灌注5 h组相比具有非常显著差异（P0.01）。表1IgG染色分级评分Tab 1 Grading score for IgG (±s, n=42)GroupAfter the reperfusion0h3h 5h12h 24hReperfusion0 0 0.43±0.122.15±1.06* 2.62±1.13*Sham-operated 0 P0.05， P0.01，vs 0

8、 h group，3 h group and sham-operated group； * P0.01，vs 5 h group 讨论脑缺血再灌注损伤是目前国内外研究的重点课题之一。为此，建立了各种脑缺血再灌注模型。我们曾采用MRI及TTC染色的方法对改进的脑缺血再灌注模型进行了研究，证明了模型复制的可靠性3。脑缺血再灌注后BBB会受到损伤，导致通透性增加。血清蛋白不能通透完整的BBB，如果脑组织中有外渗的血清蛋白，即说明BBB受到破坏，通透性增加。IgG是一种内源性的血清蛋白，通过IgG在脑组织中的免疫组织化学染色可反映BBB的通透性。目前常用来研究BBB通透性的方法有同位素标记的方法、影像

9、学方法（如增强MRI）、酶组织化学的方法等。同位素标记的方法可精确定量的反映BBB的通透性，但存在放射性及价格较贵。影像学方法可在活体进行动态观察BBB的通透性，但较难发现轻微的BBB通透性改变。酶组织化学的方法反映BBB通透性的同时，还能进行组织细胞的形态学观察，但灵敏度不及免疫组织化学的方法。用免疫组织化学的方法评价BBB通透性，不仅可以了解血清蛋白从微血管内外渗的情况，而且能进行形态学观察。可以很好地反映直到动物被处死之前外渗的血清蛋白的累积情况。本结果发现，假手术组、再灌注0 h组及3 h组均未见有IgG表达。而再灌注5 h组，在缺血侧纹状体可见有染色。说明在缺血1 h再灌注35 h时

10、，BBB受到破坏，通透性增加，血清蛋白开始从微血管渗出。同时也说明纹状体是再灌注期间BBB首先遭受破坏的区域。Ohtomo等4的研究表明，丘脑的外侧是缺血再灌注后BBB最先受到破坏的区域。Albayrak等5采用同位素标记的方法对局灶性脑缺血后BBB通透性进行了研究，其结果表明纹状体区的BBB最先受到破坏。这与我们的研究结果是一致的。BBB在这个区域更容易受到破坏的原因还不太清楚。可能是由于纹状体侧支循环比较少，因此抵抗缺血性损伤的能力就比较弱。我们研究还发现，在再灌注12 h时，整个缺血侧大脑半球可见IgG表达，再灌注24 h时，表达更加明显。这说明外渗的血清蛋白存在着累积增多。同时还发现大

11、量的神经细胞及胶质细胞的胞浆中可见颗粒状的棕褐色染色，这说明缺血性损伤比较严重。我们虽然只对IgG的漏出进行了研究，但在缺血性脑水肿时，IgG漏出的分布与其它血清蛋白是一致的6。故通过IgG外渗的情况可以反映整个血清蛋白外渗的情况。可见，通过IgG在微血管外的表达，可以反映BBB的通透性。我们的研究结果表明，在脑缺血1 h再灌注后35 h，BBB通透性开始增加。纹状体区的BBB较易受到破坏。王耀明（广西医科大学第一附属医院神经内科，广西 南宁 530021）莫雪安（广西医科大学第一附属医院神经内科，广西 南宁 530021）童萼塘（同济医科大学附属协和医院神经内科， 湖北 武汉 430030）

12、方瑗（同济医科大学附属协和医院神经内科， 湖北 武汉 430030）参考文献1Nagasawa H,Kogura K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusionJ.Stroke,1989,20:10371043.2Akiguchi I,Tomimoto H,Suenaga T,et al.Blood-brain barrier dysfunction in Binswanger's disease

13、;an immunohistochemical studyJ. Acta Neuropathol,1998,95:7884.3王耀明，童萼塘，肖学宏.MRI评价改进的大鼠可逆性局灶性脑缺血模型J. 卒中与神经疾病，1999,6:171173. 4Ohtomo H,Hatakeyama T,Matsumoto M,et al.Postischemic damage in the gerbil brain after brief carotid occlusion:Correlation of cerebral blood flow and immunohistochemical findingsJ.J Cereb Blood Flow Metab,1987,7:S110S116.5Albayrak S,Zhao Q,Siesjo BK.Effect of transient focal ischemia blood-brain barrier permeability in the rat:correlation to cell injuryJ.Acta Neuropathol,1997,94:158163.6Scmidt K,Szymas