重组人生长激素对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧大脑皮质Surv

1、重组人生长激素对大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质Survivin和 Caspase?3表达的影响                      作者：郭耀强 白宏英 曾志磊 刘海涛 方李鸿【摘要】  目的 观察重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)对大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质存活素(Survivin)和半胱氨酰

2、天冬氨酸特异性蛋白酶?3 (Caspase?3)表达的影响。方法 采用大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,将72只健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组、对照组和治疗组。分别于模型制作成功后1、3、5、7 d处死大鼠,采用连续切片免疫组织化学技术分别检测缺血侧大脑皮质Survivin 和Caspase?3的表达。结果 治疗组Survivin表达较对照组明显增多,而Caspase?3表达较对照组显著减少。结论 脑缺血/再灌注损伤早期应用rhGH可上调Survivin表达及下调Caspase?3表达,抑制神经元的凋亡。 【关键词】  脑缺血/再灌注损伤;重组人生长激素;Survivin;Cas

3、pase?3;细胞凋亡【Abstract】 Objective To observe the effects of recombinant human growth hormone(rhGH) on the expressions of Survivin and Caspase?3 in rats with cerebral ischemia?reperfusion injury. Methods The model of focal cerebral ischemia?reperfusion injury was made by occluding middle cerebral arter

4、y(MCA)for 2 hours and reperfusion.Seventy?two healthy male SD rats were randomly divided into the sham?operated group, control group and treatment group. And immunohistochemistry technique was used to detect the condition of the expression of Survivin and Caspase?3 in three groups respectively.Resul

5、ts The expression of Survivin was markly increased and Caspase?3 was obviously decreased in treatment group compared with control group. Conclusion It is demonstrated that treatment with recombinant human growth hormone could induce expression of Survivin and suppress the activity of Caspase?3 in ne

6、urons within the cerebral cortex. It can inhibit the neuronal apoptosis.【Key words】 Cerebral ischemia?reperfusion injury; Recombinant human growth hormone;Survivin;Caspase?3;Apoptosis重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)在1986年通过基因工程技术合成，与人生长激素(human growth hormone, hGH)结构相同，目前主要用于治疗生长激素缺乏性侏

7、儒症、烧伤、抗炎及不育症等。近年来,国内外研究表明,生长激素具有减轻大脑缺血缺氧引起的损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞存活等作用1?4,但机制还不十分清楚。目前,尚未有生长激素对脑缺血/再灌注损伤后Survivin、Caspase?3表达影响的报道。本实验通过应用rhGH观察大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质Survivin、Caspase?3表达的变化,探讨其神经保护作用的可能机制,为临床治疗探索新的方法及思路。1 材料与方法1.1 实验动物和分组 健康雄性SD大鼠72只,体质量250280 g,由郑州大学实验动物中心提供。术前禁食12 h,禁水4 h。随机分为假手术组、对照组(脑缺血/再灌

8、注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+rhGH组)3组,每组24只。1.2 主要试剂和药物 重组人生长激素注射液由长春金赛药业有限责任公司生产; Survivin多克隆抗体及Caspase?3多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ生物技术公司。1.3 大鼠脑缺血/再灌注模型的制备及处理 线栓法大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型采用改良的Longa5线栓法,大脑中动脉(MCA)阻断2 h后,将尼龙栓线拔出,实现再灌注。假手术组除不插线外,其余步骤与对照组和治疗组相同。参照 Zea Longa 5级4分制评分标准5，评分为13分的实验动物入选。治疗组在脑缺血/再灌注模型成功后开始颈部皮下注射重组人生

9、长激素0.1 U?kg?1? d?1,1次/24 h。对照组注射同样剂量生理盐水,注射时间与次数同治疗组。1.4 组织切片和免疫组化检测 分别于脑缺血/再灌注后1、3、5、7 d处死大鼠,以4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋和切片。常规脱蜡、水化,取缺血侧大脑皮质,按试剂盒提供的实验步骤进行操作,DAB显色,光镜下观察,胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。1.5 免疫组化结果分析 在光镜下观察Survivin 和Caspase?3免疫反应的结果,并采用Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科学仪器有限公司) 图像分析系统进行图像定量分析。Survivin 和Cas

10、pase?3免疫组化染色标记强度用灰度值表示,比较各组阳性区平均灰度值的差异。1.6 统计学处理 所有数据采用SPSS 13.0软件处理,各组数据以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,用LSD?t法进行两两比较,检验水准=0.05。2 结果2.1 大脑皮质Survivin表达的变化 假手术组大鼠脑组织中Survivin仅有少量表达,对照组13 d达到高峰,随后逐渐降低,至7 d仍有较高水平的表达,较假手术组显著升高;治疗组较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。2.2 大脑皮质Caspase?3表达的变化 Caspase?3在假手术组少量表达,对照组13

11、d达到高峰,后开始下降,至7 d时仍高于假手术组;治疗组较对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。表1 各组Survivin表达的变化(阳性区平均灰度表示)注：与假手术组同一时间点比较,P<0.05;与对照组同一时间点比较, P<0.05表2 各组Caspase?3表达的变化(阳性区平均灰度表示)注：与假手术组同一时间点比较,P<0.05;与对照组同一时间点比较,P<0.053 讨论脑缺血/再灌注损伤是一种常见的、复杂的病理生理过程。有研究表明6,脑缺血后随着再灌注时间的延长,缺血侧皮层凋亡细胞数量明显增加,主要分布在梗死灶边缘区,48 h凋亡细

12、胞达到高峰,说明凋亡在脑缺血/再灌注损伤中起重要作用。半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteing aspartate specific protease, Caspase)特别是Caspase?3处于凋亡过程的下游阶段,是凋亡过程中的关键蛋白酶,及时抑制凋亡级联反应过程中的关键蛋白酶,挽救缺血半暗带区尚未凋亡的神经元是脑血管疾病治疗的关键。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员,是至今发现作用最强的凋亡抑制蛋白之一,既能抑制细胞凋亡,又能诱导调控神经细胞的有丝分裂及生长周期时相,促进神经细胞增殖和血管生成等7?8。脑缺血/再灌注损伤能促使缺血侧脑组织Survivin强烈持续高表达。我们

13、实验观察到脑缺血/再灌注损伤后Survivin表达升高,13 d达到高峰,随后逐渐降低,至7 d仍有较高水平的表达,提示Survivin在脑缺血/再灌注损伤早期即参与抗凋亡的复杂生理过程。应用rhGH干预后Survivin表达显著升高,说明脑缺血/再灌注损伤早期应用rhGH,可以增加Survivin 的合成和分泌。同时发现,脑缺血/再灌注损伤后Caspase?3表达升高,至再灌注13 d达到高峰,随后开始下降,至7 d时仍高于假手术组,结果与国内外报道一致,表明脑缺血/再灌注损伤与细胞凋亡存在密切的联系,参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程。有研究认为9?10,生长激素可能通过NF?kappa

14、B 介导的信号转导途径产生抗凋亡蛋白Bcl?2 和BAG?1,促进细胞存活。也有实验发现2,心肌缺血/再灌注24 h后生长激素组心肌细胞的凋亡以及凋亡相关基因Caspase?3、Cleaved Caspase?3蛋白阳性染色细胞数均明显少于心肌缺血/再灌注组。我们研究发现应用rhGH干预后Caspase?3表达较对照组显著下降,提示rhGH可能直接或间接通过抑制Caspase?3活性,抑制神经元的凋亡。另有研究表明11,Survivin可能直接抑制Caspase?3和Caspase?7的活性,阻断凋亡信号诱发的细胞凋亡,从而抑制细胞凋亡,发挥脑保护作用。综上所述,我们认为脑缺血/再灌注损伤早期

15、应用rhGH治疗,可上调Survivin表达，下调Caspase?3表达,抑制神经元凋亡,但其具体的信号转导通道目前尚不清楚,有待进一步研究。【参考文献】  1 Azcoitia I, Perez?Martin M, Salazar V, et al. Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampusJ.Neurobiology of Aging,2005,26(5):697?703.2 黄瑞健，李萌，孙培吾.生长激素对大鼠心肌缺血/再灌注后心肌细胞凋亡及凋亡相关基因Caspase?3 Cleaned

16、caspase?3蛋白表达的影响J.中国急救医学,2008,28(6):527?530.3 Shin DH, Lee E, Kim JW, et al. Protective effect of growth hormone on neuronal apoptosis after hypoxia?ischemia in the neonatal rat brainJ.Neuroscience Letters,2004,354(1):64?68.4 Scheepens A, Sirimanne ES, Breier BH, et al. Growth hormone as a neuronal

17、rescue factor during recovery from CNS injury J. Neuroscience, 2001，104(3):677?687.5 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in ratsJ.Stroke, 1989, 20(1): 84?91.6 段智慧，白宏英，娄季宇,等. 垂体腺苷酸环化酶激活肽对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血皮层p?JNK表达及神经细胞凋亡的影响J.中国实用神经疾病杂志,

18、2007,10(2):51?53.7 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti?apoptosis gene，Survivin，expressed in cancer and lymphomaJ.Nature Med，1997，3(8)：917?921.8 Conte MS，Altieri DC. Survivin regulation of vascular injury J.Trends in Cardiovascular Med，2006，16(4)：114?117.9 Jeay S, Sonenshein GE, Postel ?Vinay MC, et al. Growth hormo