轻度低温对脑缺血再灌注后胶质细胞酸性蛋白表达的影响

1、轻度低温对脑缺血再灌注后胶质细胞酸性蛋白表达的影响摘要目的：观察轻度低温对脑缺血再灌注后星形胶质细胞活性和组织病理变化的影响。方法：沙土鼠24只，随机分非缺血对照组，缺血对照组和轻度低温组(32o33)。夹闭双侧颈总动脉20min再灌注48h，采用免疫组织化学法检测GFAP表达及HE染色观察组织病理变化。结果：象分析显示缺血对照组GFAP表达的灰阶值与非缺血对照组比较明显增强(P0.01)，且阳性细胞数增多，胞体肿胀。轻度低温组GFAP表达基本恢复到非缺血对照组水平(P0.05)。缺血对照组海马区部分细胞缺失，有的核固缩；而轻度低温组及非缺血对照组则结构基本正常。结论：轻度低温能明显抑制脑缺血

2、后星形胶质细胞活性，减轻胞体肿胀，并能减轻海马区组织损害程度。关键词缺血再灌注损伤GFAP胶质细胞低温病理组织学 Effect of mild hypothermia on the glial fibrillary acidic protein and pathological change following cerebral ischemia and reperfusion injury in gerbilsLiu Xeuping,Wang Fengyan,Gao Ling,et al.Department of Neurology,Shandong Provincial Hospital

3、,Jinan,250012AbstractObjective:To observe the effects of mild hypothermia on the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and pathological change after cerebral ischemia and reperfusion injury.Methods:Twenty-four gerbils were divided into three groups:sham-operated,ischemia and hypotherm

4、ia(32o33).Cerebral ischemia lasted 20 minutes by occluding bilateral common carotid and reperfusion for 48 hours. The GFAP expression was investegated with immunohistochemistry and pathological changes evaluated by hematoxylin and eosin stained section.Results:The result showed that GFAP immunoreact

5、ivity in ischemic gerbils significantly increased and astrocytes were swelling compared to sham-operated gerbils by optical density analysis (p0.05).Compared with the ischemic gerbils,mild hypothermia could significantly reduce the pathological change of postischemia brain structure and decrease the

6、 number loss of pyramidal neurons.Discussion:The result indicated that mild hypothermia could markedly inhibited the activation and swelling of astrocyte as well as prevented pathological change.KeywordsCerebralischemia Reperfusioninjury Hypothermia GFAP Histopathology脑组织中存在大量胶质细胞，其在脑损伤过程中的作用越来越受到重视

7、。星形胶质细胞在脑缺血损害过程中极易被激活，并在脑缺血病理生理发生发展过程中起着重要作用。轻度低温被认为是治疗脑梗死最理想的治疗措施之一，而轻度低温对星形胶质细胞的影响则罕有报道。本研究旨在研究脑缺血及再灌注后胶质细胞酸性蛋白(GFAP)在星形胶质细胞中的表达和组织病理变化及轻度低温对其影响。现将研究情况报道如下。1材料与方法1.1实验方法及分组雄性沙土鼠24只，购自上海畜牧医学技术服务站，体重5080g，随机分非缺血对照组、缺血对照组和轻度低温治疗组。1.2脑缺血模型采用常规前脑缺血再灌注模型，用1%戊巴比妥钠30mg.kg-1麻醉，颈正中切口，切开皮肤及皮下组织，分离双侧颈总动脉并用血管夹

8、夹闭20min时松夹，恢复血流。其中缺血对照组在手术中采用电热垫保持颞肌温度3712h(采用半导体测温仪测温)，于再灌注48h断头；轻度低温治疗组自夹闭双侧颈总动脉始，头背部放于冰块上，至10min内使颞肌温度降至3233，并维持12h后自然复温，余步骤同缺血组；非缺血对照组除不夹闭血管外，全过程同缺血对照组。动物断头后迅速将脑组织取出，用4生理盐水将表面血洗去，自顶叶中部冠状切面用4%多聚甲醛固定。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。1.3测定方法1.3.1免疫组织化学测定GFAP试剂盒购自武汉博士德公司，常规石蜡切片5m，脱蜡，梯度酒精加水，切片于3%过氧化氢液体中浸泡30min，PB

9、S漂洗3次，滴加山羊血清10min，抛掉多余血清，滴加GFAP一抗(1：200)4过液。然后，PBS洗3次，生物素化二抗37孵育40min，PBS洗3次，加SABC37孵育60min，PBS冲洗后滴加DAB显色液，镜下观察，蒸馏水中止反应，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明封片。结果用象分析系统进行象分析。1.3.2组织病理切片采用常规HE染色法，观察组织病理变化。1.3.3统计学处理数据用“均数标准差”表示，采用方差分析t检验，组间比较用F检验。2结果2.1免疫组织化学法测定GFAP，非缺血对照脑皮质GFAP无明显表达，阳性细胞主要分布在皮质下及海马区。象分析显示，缺血对照组GFAP表达在上述区域

10、灰阶值比非缺血对照组明显增强(P0.01)，且阳性细胞数增多，树突增粗，胞体肿胀，部分胞体破裂。轻度低温治疗组GFAP表达基本恢复到非缺血对照组水平。未见胞体肿胀。见表1、1。表1脑缺血后48h纹状体区GFAP表达分组象分析灰阶值非缺血对照组28.716.22缺血对照组37.648.23*轻度低温治疗组29.446.41+注：与非缺血对照组比较，*p0.05;与缺血对照组比较，p0.011.1非缺血对照组(200)星形胶质细胞GFAP表达1.2缺血对照组(200)GFAP在星形胶质细胞中表达1.3轻度低温治疗组(200)GFAP在星形胶质细胞中表达2.2组织病理变化，缺血对照组细胞周围间隙增大

11、，神经细胞胞浆染色深，特别是海马CAI区细胞减少，有的核固缩，结构层次不清楚；轻度低温治疗组及非缺血对照组皮层及海马区结构基本完好。见2。2.1轻度低温治疗组(100)海马区CAI神经细胞2.1缺血对照组细胞(100)海马区CAI神经细胞3讨论动物实验证明13，脑缺血后可诱导脑组织胶质细胞活性增高(包括星形胶质细胞、小胶质细胞)，它在脑缺血发生、发展过程中起着重要作用。GFAP是星形胶质细胞标志蛋白，常被用来区别星形胶质细胞及作为其活性指标。我们的实验显示，非缺血对照组GFAP在星形胶质细胞中表达不明显，且树突较细，主要分布在白质区，脑缺血20min后再灌注48h脑皮质、白质均见星形胶质细胞G

12、FAP表达增强，且树突较粗，尤其在海马区，油镜下发现海马区有散在星形胶质细胞胞体肿胀，有的破裂。提示脑缺血能够引起星形胶质细胞活性增强，且胞体肿胀。结合组织病理观察发现海马区神经细胞部分缺失，结构破坏。轻度低温3212h后GFAP表达几乎恢复到非缺血状态，而且海马区星形细胞无肿胀，结构完整。组织病理发现海马区结构基本完好。表明轻度低温既能减轻星形胶质细胞胞体肿胀，恢复其正常活性，又能明显减轻海马区病理损害。上述结果支持Kumar提出的轻度低温抑制GFAP在星形细胞中表达的报道4。在正常情况下，星形胶质细胞参与血脑屏障形成，吸收谷氨酸(Glu)，维持细胞内外物质转运及酸碱平衡。当脑缺血缺氧时，星

13、形胶质细胞极易被激活。星形胶质细胞活性增强有着正、反两方面的作用，一方面其自身分泌大量神经营养因子：如神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，对脑组织损伤起着潜在有益作用；另一方面，当神经细胞内环境发生改变，直接刺激胶质细胞后，导致多种神经毒性作用产生48：(1)星形胶质细胞释放大量Glu。有实验证实，当脑缺血时Na+、K+跨膜梯度被破坏，星形胶质细胞膜高亲和性摄取载体活动把胞浆内Glu排出体外。Mitani等在体内实验去除海马CAI区神经元传入突触，引起星形胶质细胞增生，发现缺血5min内Glu无改变，10min细胞外Glu增高，120min达正常细胞时的32倍。提示缺血时星形胶质细胞增生，摄

14、入Glu消失，并释放大量Glu引起神经毒性。(2)星形胶质细胞活性增高，可产生过量细胞因子(如IL-I、IL-6、TNF-)，这些细胞因子在缺血期间高表达直接介导脑组织免疫应答，增加毛细血管通透性，造成微小血栓形成，加重脑损害。(3)诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)表达的体内外实验已证实，IL-I、TNF-等因子刺激均可使星形胶质细胞构造型NOS及iNOS激活，产生大量NO，在脑缺血数小时后过量NO主要由iNOS产生，参与迟发性神经元损害。(4)加重脑水肿，脑缺血时ATP耗竭，Na+、K+-ATP酶功能障碍使胞内Na+、K+浓度增高，细胞产生去极化，加之水、CI-能自由通过细胞膜，导致细胞内水

15、肿，而胶质细胞对缺血、缺氧较神经元敏感，故极易引起细胞肿胀，参与脑水肿形成，失去其本身的摄取胞内外离子，维持细胞内外酸碱平衡的功能68。我们的实验已证实，在海马区大量胶质细胞体肿胀，而轻度低温能明显恢复星形胶质细胞的正常活性并避免胶质细胞本身肿胀。据此，我们推测，轻度低温可改善细胞内环境，恢复胶质细胞正常活性，减少其胞体水肿，而达到脑保护目的。作者单位：250011山东省立医院参 考 文 献1Araki T,Kato H,Liu X H,et al.Induction of heat shock protein 70 and glial fibrillary acidic protein in

16、 the postischemic gerbil hippocampus.Metab Brain Dis,1994,9(4):369375.2Kato H,Kogure K,Araki T,et al.Astroglial and microglial reactions in the gerbil hippocampus with induced ischemic tolerance.Brain Res，1994,664:6976.3Palacios G,Mengod G,Tortosa A,et al.Increased beta-amyloid precursor protein exp

17、ression in astrocytes in the gerbil hippocampus following ischemia association with proliferation of astrocytes.Eur J Neurisci,1995,7(3):501510.4Kumar K,Wu X,Evans A T:GFAP-immuniorreactivity following hypothermia forebrain ischmeia.Metab brain Dis ，1996,12(1):217.5Szaflarski J,Burtrum D,Silverstein F S:Cerebral hypoxia ischemia stimulates cytokine gene expression in perinatal rats.Stroke，1995,26(6):10931100.6Mitani A,Andou Y,Mastuda S,et al.Origin of ischemia-induced glutamate efflux in the CAI field of the gerbil hippocampus:An in vivo brain microdialysis study.J Neurochim,1994,