跨界正流行以定量pcr 来分析蛋白

1、 定量 PCR 能分析蛋白吗?你肯定会说,开玩笑。不过这是千真万确的,一向以创新著称的美国应 用生物系统公司刚刚推出了 TaqMan Protein Expression Assays,首次应用 TaqMan 分析与实时定 量 PCR 来定量蛋白表达,能对有限数量的人胚胎干细胞培养物中的多能标志物进行快速轻松的鉴定及 相对定量。细胞的鉴定是一个新兴的领域, 直到现在,TaqMan 5这个试剂盒究竟是如何定量的。 其实它是基于一项新颖的检测方法,称为 PLA - Proximity Ligation Assay技术。 PLA 利用亲和 系统来定量检测蛋白的 存在,适用于含 10-500(就 是带

2、了一段 oligo 尾巴的抗体共同孵育。每个蛋 白设计有两个探针 A 和 B 。之后用 DNA 连接酶将 两段 oligo 连接起来, 如图 1所示。 经过酶的灭活, 就能够进行实时定量 PCR 了。没有洗 涤步骤,所需的细胞量比 western blot方法低 100-500倍。与传统的 基因表达分析一 样, TaqMan 蛋白表达分析所得的数据很容易进 行相骤, 能释放所有类型的蛋白, 此 步骤与 TaqMan试剂结合,创造出高度灵敏而特 异的过程, 来测定少量样品中的蛋白表达。 整个实 验过人胚胎干研究人员还需要使用颇费劳力的蛋白分析技 术, 如流式细胞术、 免疫染色及 western

3、blot分析。 这些方法不够灵敏,本身也很难定量。 TaqMan 蛋白表达分析则采用一步法裂解样品及简化的实 时定量 PCR 流程, 3.5小时就能从样品中获得数 据,而所需样品量只有其他方法的 1/100-1/10。TaqMan 蛋 白 表 达 分 析 利 用 金 标 准 的 核酸酶试剂来定量蛋白表达, 其工作 流程和样品量与普通的 mRNA 及 microRNA 分析 相似。由于蛋白表达结果是来自相同的分析平台, 那么这些创新的分析能够将 mRNA 和 /或 miRNA 的表达与蛋白表达直接关联。 其它任一种蛋白定量 分析方法都不具备这个能力。新颖的原理你一定很纳闷纯 化的抗体和实时定量

4、PCR个细胞的裂解液。首先将细胞裂解,然后与抗体 -oligo-探针这些预先设计的分析非常简单且可靠, TaqMan对定量, 且极其适合多能和分化干细胞中的标 志物相对定量。简化的流程TaqMan 蛋白表达分析流程运用了简单的 一步法样品裂解步程, 从样品到数据, 在 3.5小时内就能完成 (图 2,操作时间仅为 1.5小时。所有试剂都已为分 析细胞培养物中的蛋白而优化。样品制备过程温 和, 一步法细胞裂解用的是非离子型去污剂。 随后 样品能与任何蛋白表达分析试剂盒的分析探针混 合,而分析探针的结合需要 60分钟。然后加入连 接酶将寡核苷酸连接起来,接着是 15分钟的灭活 或纯化步骤, 来消化

5、所有蛋白。 再通过单次的板转 第 12 页,共 22 页 下一页 返回 移将试剂转移到 PCR 平板上,进行快速实时定量 PCR 。图 2. TaqMan蛋白表达分析的详细流程。每反应分而开发,包括 hICAM1、 hCSTB 、 hOCT3/4、 hNANOG 、 hSOX2和 hLIN28,再加 上支持试剂来监测人胚胎干细胞的相对蛋白水平。 TaqPCR能 够 在 Applied Bios 速实时定量 系统上进 小时内得到实时定量的实时定量让实时 定量 比以往更容易开展。 有了新一代软件, 这 些 系 统 简 单 , 当 然 , 它 们 还 有 着无人可比的性能、 质量以及长期可靠性 关于

6、我们快速实时定量 系统 的 完 整 产 品 信 息 , 请 登 陆个反应孔只需要 2 uL起始样品(10-500个细胞 /uL。对于 TaqMan分析的步骤 4, 10 uL连接 样品再加上混合液, 构成了 20 uL的实时定量 PCR 终体积。便利易用的 析预先设计的 TaqMan 蛋白表达分析是专为 一些人蛋白靶点Man 蛋白表达分析产品线还包括核心试剂 盒、 阳性与阴性对照样品细胞裂解液试剂盒, 以及 免费的数据分析软件。 核心试剂盒中包含分析运行 所需的所有试剂,包括连接体寡核苷酸、连接酶、 通用的 TaqMan分析、 新的 TaqMan 蛋白表达 快速混合液, 需要与每个蛋白表达分析

7、试剂盒一起 运行分析。可靠的实时定量 平台TaqMan 蛋 白 表 达 分 析ystems 的任一台快 PCR行,并在一 PCR 的结果。 Applied BiosystemsPCR 系统提供了 强大的解决方案来满足任何实验室的需求, PCR使 用 Applied Biosystems的记录作为支持。 PCR 。s 实时定量 PCR 系统 所提供的精密软件包有助于实验设定、分析性能测试。 免费的 TaqMan 蛋白表达分析数 据分析软件工具可在直观的数据分析软件所有 Applied Biosystem数据收集和 下过 分 析 设 计 的 创 新 改 变 , Applied Biosystems品, 尽在 2009十大创新产品评选, 欢 载。通将 TaqMan分