异丙酚对沙土鼠全脑缺血再灌注后脑保护作用研究

1、异丙酚对沙土鼠全脑缺血再灌注后脑保护作用研究         11-04-01 09:25:00     编辑：studa20                   作者：沈宁， 甘小亮， 黑子清， 庞红宇， 罗刚健 【摘要】  【目的】 观察异丙酚对沙土鼠全脑缺血再灌注后脑保护作

2、用。【方法】 27只雄性清洁级蒙古沙土鼠，随机分为对照组、模型组、异丙酚组，每组9例。对照组：游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流。模型组： 游离双侧颈总动脉并阻断脑血流，10 min后开放动脉，2 h后取材。异丙酚组：在开放动脉后即经舌静脉以Grassby3000微量泵持续以10 mg·kg-1·h-1的速度输注异丙酚，2 h后取材。实验结束后，处死动物取脑组织分别固定后行HE染色光镜观察，免疫组化SP染色类胰蛋白酶表达观察，透射电镜观察超微结构，脑含水量测定，脑组织匀浆测定MDA含量、SOD活性、TNF-和IL-1含量。【结果】 模型组和异丙酚组脑组织含水量高于对照组(P &

3、lt; 0.05)，异丙酚组低于模型组(P < 0.05)。光镜下及电镜下模型组脑组织损伤严重，异丙酚组损伤较轻，对照组脑组织结构基本正常 。三组中， MDA含量、TNF-浓度、IL-1含量、类胰蛋白酶表达以模型组最高(P < 0.05)。SOD活性以模型组最低(P < 0.05)。 【结论】 异丙酚对沙土鼠全脑缺血再灌注后有明显的脑保护作用，其机理与抗氧化及抑制炎性因子释放相关，而肥大细胞也可能参与了脑缺血再灌注损伤。 【关键词】  异丙酚; 脑; 缺血再灌注; 类胰蛋白酶Abstract： 【Objective】 This study was designed

4、to observe the protective effects of propofol on global cerebral ischemia-reperfusion injury and changes of malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD) activity， tumor necrosis factor-alpha (TNF-)， interleukin-1beta (IL-1) and the expression of tryptase in brain of gerbils. 【Methods】 Twenty-se

5、ven healthy gerbils (55-70 g)， were randomly divided into three groups： control group (n = 8， sham operation having surgical procedures without bilateral carotid arteries occlusion)， model group (n = 8， having surgical procedures with bilateral carotid arteries occlusion)， propofol group (n = 8， hav

6、ing the same surgical procedures with bilateral carotid arteries occlusion， and propofol i.v. by Grassby 3000 syringe pump with the speed of 10 mg/kg/h via lingual vein). The animals were then killed and the thalamus opticus were removed as soon as the experiment was over. The thalamus opticus was f

7、ixed by formaldehyde. HE dyeing before observation under light microscope and use of immunohistochemistry method with SP dyeing to observe the expression of tryptase. The surplus left brain tissue were made into tissue homogenate and preserved at -40 to determine the content of MDA， SOD activity， TN

8、F-， and IL-1. The right brain tissues were got wet weight and dry weight respectively to calculate the moisture capacity of brain with Eliot formula. Furthermore， we take an animal from three groups respectively to observe the ultramicrostructure of brain by electron microscopy. 【Results】 Moisture c

9、apacity of brain of model group was the highest among three groups while that of propofol group is less than model group (P < 0.05). The outcomes of light microscope showed that damage of brain tissue of model group was most severe among the three groups and the contents of MDA， TNF-， IL-1 and tr

10、yptase of model group was also highest as well. Contents of MDA of propofol group decreased obviously compared with model group. The SOD activity was the lowest in the model group. 【Conclusion】 Propofol can protect ischemia-reperfusion injury in brain by antioxygen and refraining inflammatory factor

11、s and mast cell perhaps play an important role during the development of ischemia-reperfusion injury.脑缺血再灌注时，肥大细胞存在大量活化现象，脑缺血后肥大细胞出现脱颗粒现象可能在脑缺血再灌注损伤中起了重要作用，而脱颗粒释放的炎症介质又可进一步加重组织的炎症反应，形成恶性循环1。因此，我们设想：在脑缺血-再灌注过程中肥大细胞活化可能是导致脑损伤加重的重要环节之一。异丙酚是临床十分常用的麻醉镇静药2-3，有研究显示异丙酚具有一定的脑保护作用4。另外，一些学者观察到异丙酚对肥大细胞活化和脱颗粒有抑制

12、作用，但用异丙酚在脑缺血-再灌注过程中来干预这一环节进行防治的研究尚未见文献报道。本实验旨在进一步研究异丙酚干预沙土鼠脑缺血再灌注后氧化产物、炎性细胞因子及脑内肥大细胞标志物类胰蛋白酶变化，并通过对缺血脑组织光镜及超微结构的观察，进一步说明异丙酚对脑缺血再灌注损伤有保护作用，为异丙酚在临床上的进一步应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 动物分组健康，雄性清洁级蒙古沙土鼠27只，体质量55 70 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：0001382。在实验前均在卫生的环境中饲养，自由摄食、饮水。沙土鼠随机分为：对照组(control)，游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流。模型组(model)：

13、游离双侧颈总动脉并阻断脑血流，10 min后开放动脉，2 h后取材。异丙酚组(propofol)：在开放动脉后即经舌静脉以Grassby3000微量泵持续以10 mg·kg-1·h-1的速度输注异丙酚(AstraZeneca，Italy) 2 h后取材。1.2 动物模型建立30 g/L戊巴比妥钠45 mg·kg-1腹腔注射麻醉，将动物仰卧在实验台上，剪开颈部正中皮肤，分离双侧颈总动脉、套线，然后用微动脉夹同时阻断双侧颈总动脉血流造成脑缺血，检查远端血流情况以确保完全阻断血流。脑缺血时间为10 min，松开动脉夹恢复脑血流即为再灌注。对照组仅游离双侧颈总动脉但不阻断

14、脑血流。1.3 标本处理断头处死动物(每组8只)，快速取出脑组织并取丘脑约1 cm3， 40 g/L多聚甲醛溶液固定，病理切片，HE染色光镜观察及免疫组化SP染色类胰蛋白酶表达，剩余脑组织正中矢状切分左右大脑，左侧制成组织匀浆，-40 保存，测定MDA、SOD、TNF-、IL1-。右侧脑组织取出后迅速吸尽表面水份，用于脑含水量的测定。另取模型组、对照组、异丙酚组动物各一只，运用左心室灌注固定取材方法，于左心室处注入25 g/L戊二醛(sigma，USA)约100 mL，将其全身灌注固定，冰皿上断头从丘脑区同一部位取材，体积约1 mm3大小，立即放入25 g/L戊二醛缓冲液中固定4 h，用10

15、g/L锇酸(sigma，USA)作用2 h，梯度酒精脱水，Epon812包埋，超薄切片，经电子染色，用H-600透射电镜(HITACHI，JAPAN)观察超微结构。1.4 观察指标在光镜下(LEICA，GERMANY)观察脑组织病理损伤情况。透射电镜下(H-600 HITACHI，JAPAN)观察超微结构变化。右侧脑组织用分析天平称取湿质量后放入105 恒温烤箱，烘烤48 h后称取干质量，计算脑组织含水量(用Eliot公式计算，含水量(%) = (湿质量-干质量)/湿质量 × 100%)。采用硫代巴比妥酸反应法测定MDA含量。黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。采用ELISA方法测定TNF

16、-含量和IL-1含量。丘脑组织免疫组化SP染色肥大细胞类胰蛋白酶表达、计数。1.5 统计学处理计量资料以均数 ± 标准差(x ± s)表示，采用方差分析比较各组的差异。取 = 0.05。2 结 果2.1 丘脑组织HE染色病理学结果对照组：脑组织均匀，神经元排列整齐、致密，胞核无固缩、变形，胞浆无水肿;异丙酚组：脑组织损伤较轻，大部分神经元结构基本正常，少数神经元胞核固缩，胞浆水肿;模型组：脑组织损伤明显，出现大片液化坏死区域，神经元坏死性变性，胞核固化、溶解、消失，细胞周边呈扇形空泡改变(图1)。2.2 丘脑组织超微结构变化对照组：神经元结构清晰，胞核及胞浆结构正常，线粒体

17、无肿胀，嵴清晰。异丙酚组：神经元结构基本正常，胞核无固缩，线粒体稍肿胀，嵴稍模糊，管周稍水肿;模型组：胶质细胞破裂、溶解，周围神经毡肿胀，神经元胞核固缩，线粒体肿胀，嵴消失，管周水肿(图2)。2.2 脑组织含水量.脑组织含水量模型组显著升高(P < 0.05)，异丙酚组低于模型组和高于对照组(P < 0.05;表1)。2.3 脑组织SOD活性和MDA含量三组中， SOD活性以模型组最低(P < 0.05)，异丙酚组与对照组相比，SOD活性无统计学意义(P > 0.05)，MDA含量以模型组最高(P < 0.05)，对照组最低(P < 0.05，表1)。2.4 脑组织TNF-、IL-1含量变化与对照组比较，模型组TNF-浓度明显升高(P < 0.05);与模型组相比，异丙酚组TNF-浓度明显降低(P <