牛干扰素-tau基因的原核表达及生物功能鉴定

1、农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology2008,16(2):208­213 · ·研究论文牛干扰素­tau基因的原核表达及生物功能鉴定 * * 高方方 1 , 吴忠义 2 , 曾申明 1 2.北京市农林科学院生物中心， （1.中国农业大学动物科技学院， 北京 100094； 北京 100097）PCR方法直接从牛早期胚胎细胞中扩增牛干扰素 ­tau（bovineinterferon­tau

2、, 摘要：采用 载体中。 然后将含信号肽和不含信号肽的并克隆到 pGEM­T 基因，片段分别与原核表达载体pET­30a(+)连接， 并用 IPTG诱导表达。 重组蛋白经XM­593584） 基因， 与 GenBank（序列相比， 核苷酸和2+实验结果显示， 以胚胎裂解液为模板、 不 Ni 亲合层析纯化后， 通过抗病毒检测和对靶细胞形态变化的影响检验其生物学功能。（5 枚） 提取胚胎基因组 DNA， 可以从少量 的牛囊胚中直接扩增出经 SDS­PAGE 电泳检测发现约在 20kD 处出现 氨基酸的同源性分别为99%和 97%； 不含信号肽序列的

3、重组质粒诱导表达后， 特异性蛋白条带， 与目标蛋白分子量一致； 纯化后重组蛋白的抗病毒活性单位为 1伊10 在牛子宫内膜上皮细胞培养液  4 IU/mg； 细胞内出现囊泡状结构。表明实验获得了具有一定生物活 中添加 2.9滋g/mL纯化的rbIFN­蛋白后24h， 细胞体积明显增大，  性的rbIFN­蛋白。关键词：牛原核表达； 生物活性 ； 克隆；中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:1006­1304(2008)02­0208­06 Expressi

4、onofBovineInterferon­tauin IdentificationofItsBiologicalActivities 1 2 1 GAOFang­fang ,WUZhong­yi ,ZENGShen­ming * and Thegeneencodingforbovineinterferon­tauwithsignalsequence,wasobtainedthroughPCRfrombovine fragmentswit

5、hsignalsequenceorwithoutsignal genecouldbeobtained earlyembryosandsubclonedintopGEM­Tvector.Afterbeingverified,the sequencewereinsertedintotheexpressionvectorpET­30a(+),respectively.Tworecombinantplasmidswereinducedtoexpressthe recombinantproteinsbyisopropyl 茁­D

6、73;1­thiogalactopyranoside,respectively.Theresultsshowedthat  fromfivebovineblastocystsbyPCRwithoutextractionofgenomicDNA.Itshomologieswere99%innucleotideacidsand97%in aminoacidstothesequenceinGenBank(XM­593584).TheproductsofrbIFN­子withminussignalsequenceexpressedinpET&

7、#173;30a(+)  wereanalyzedbySDS­PAGE,andanewproteinof20kDwasdetected.Itsmolecularweightwasthesameasexpected.Theantiviral activityofrbIFN­子wasobviousmorphologicalchanges  1伊10  4 IU/mgusingstandardcytopathicreductionassay.TherbIFN­子induced in

8、bovineendometrialepithelialcells tainedinthisexperiment. bovineclone；expression； biologicalactivity Thecellvolumewaslargerthanthatofthecontrolandalotofvesiclesappearedinthe cytoplasmsafter24hcultureinpresenceof2.9 滋g/mLrbIFN­子.Inbiological activitieswasob­ 

9、60; conclusion,thepurifiedrbIFN­子with IFN­子是反刍动物胚胎滋养层细胞分泌产生一属于玉型干扰素的一个新家族， 在维 类酸性糖蛋白，持黄体功能和妊娠建立过程中发挥重要的生物学功其肽 基因具有一个 585bp 的开放阅读框，链含有 195个氨基酸残基， 包括含 23 个氨基酸残基 的信号肽和 172 个氨基酸残基的成熟肽(Imakawa国家自然科学基金 （No.30571333） 科技支撑计划 （No.2006BAD14B08­05） *基金项目： 和国家 “十一五” 资助。主要从事动物繁殖与胚胎生物技术的研

10、究。E­mail： *通讯作者。Authorforcorrespondence.教授， <zengsm>. 博士生导师， 2007­07­11 接受日期： 2007­08­26 收稿日期：第 2期 高方方等：牛干扰素­tau基因的原核表达及生物功能鉴定2091987 Stewert 1987Charpigny 1988) 。IFN­子通过旁分泌作用于子宫内膜上皮细胞，抑制 PGF2琢的合成与脉冲式释放， 使周期黄体转化为妊 娠黄体，继而黄体分泌足够量的孕激素以建立和维 持适宜的子宫环

11、境， 促进胚胎附植和胎儿发育(Mar­ tal 。 IFN­子被认为是反刍动物早期胚胎传递给母体的最初妊娠信号，目前其调节胚胎附植的 机制还不完全清楚(Spencer 。 本研究采用牛的早期胚胎克隆基因，并在原核中表达具有生物活性的 IFN­子蛋白，为深入探讨反刍动物妊 娠识别的分子机制提供基础资料。1 材料和方法1.1 材料牛体内受精胚胎由北京安伯胚胎生物技术中心 提供；大肠杆菌DH5琢和 BL21 DE3）、 pET­30a(+) 载体由北京市农林科学院生物 中心吴忠义副研究员和王永勤副研究员提供；牛肾细胞和水泡口炎病毒

12、 （VSV） 由中国农业大学动物医学院汪明教授提供； pGEM­T 载体(Promega,USA）；一步法 RT­PCR 试剂盒、 DNA 限制性内切酶、 T 4 DNA连接酶、 Ex DNA聚合酶(TaKaRa,Japan）；ProBond TM PurificationSystem 试剂盒 (Invitrogen, USA），考马斯亮兰 R­250(Sigma,USA），超滤管 (Milipore,USA）， 细胞培养板(Nunc,USA）。 1.2 胚胎准备将含有牛胚胎的细管从液氮中取出，在空气中

13、停留 10s 后放入 37 水浴中解冻， 取出细管， 将胚 胎推入含有 DPBS 溶液的表面皿中， 迅速回收胚胎，并用 DPBS 洗涤 3 遍，5 枚胚胎为 1 组放入 37 预 热的酸性 Tyrode s 溶液中(Nagy 2003)， 待透 明带溶解后， 迅速用大量 DPBS 溶液中和、 洗涤， 然 后将胚胎移入含 5 滋L  冰浴裂解液的 PCR 管中，迅 速投入液氮中冷冻， 取出后原80  保存。 1.3基因的克隆根据 GenBank 中已知的基因序列，设 计 1 对引物。由于 基因没有内含子，利用该 引物可以直接从基因组中扩

14、增得到基因。PCR 反应程序： 94 ， 5min； 94 ， 45s； 58.4 ， 1 min； 72 ， 1min, 共 35 个循环，最后在 72 条件 下延伸 8min。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 并回收， 回收产物与 pGEM­T 载体连接 （方法参照 Promega 的产品使用说明）。 用重组质粒转化大肠杆 菌 DH5琢感受态细胞， 经过蓝白筛选， 挑取白色菌落，SDS­ 碱裂解法提取质粒(Sambrook andRussell， 2002)、酶切鉴定。初步鉴定正确的重组质粒进行 D

15、NA 测序，并将重组质粒命名为 pGEM­所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物： 5'­ATGGCCTTCGTGCTCTCTCTAC­3'； 下游引物：5'­AAGTGAGTTCAGATCTCCACCCA­3'。 1.4 基因原核表达载体的构建设计 2 组引物，均引入 和 酶切位点，分别用于从 pGEM­重组质粒上扩增含信号肽和不含信号肽的 基因，反应程序：94 ， 3min； 94 ， 40s； 60 ， 1min； 72 ， 1min；

16、共 30 个循环，最后 72 延伸 8min。扩增产物经 玉pET­30a(+)和 载体连接， 双酶切、回收，与经过同样双酶切的转化大肠杆菌 BL21（ DE3）， 提取质粒并验证，重组表达载体分别命名为pET­垣pET­原上游引物1：5'­ATACATATGGCCTTCGTGCTCTC­3'；下游引物1：5'­CTGCTCGAGAAGTGAGTTCAGATCT­3'。上游引物2：5'­CTACATATGTGTGACCTGTCTCCGA­3'；下游

17、引物2：5'­CTGCTCGAGAAGTGAGTTCAGATCT­3'。1.5 基因的诱导表达及纯化分别挑取含有重组质粒 pET­（垣和pET­（原50mL含卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37 活化后按 1颐10  的稀释比 例转移至新培养基中。 当细菌 =1.0 时， 添加 1伊 10 ­4 mol/LIPTG， 分别在 25 条件下慢速诱导 20hEaly 1998） 和 37 条件下快速诱导 4h， 分别离心收集菌体。 经过超声波破碎， 收

18、集沉淀，用 0.1% TritonX­100 洗涤和纯化包涵体(Sambrook andRus­ sell,2002)， 再用 10mol/L 尿素溶解， 最后得到含有rbIFN­子的上清液。参照 ProBond TM PurificationSys­ tem（ Invitrogen） 试剂盒说明书， 在活性条件下纯化rbIFN­子。 用 PBS 反复超滤 rbIFN­子3 次后 SDS­PAGE 电泳，考马斯亮兰 R­250 染色后观察结 果， 并用 B

19、radford 法测定 rbIFN­子浓度。 1.6rbIFN­ 的抗病毒活性检测在 96孔板中培养牛肾细胞，待细胞长成单层后 去除培养液， 加入细胞维持液， 同时每孔加入成倍稀释的 rbIFN­子200  滋L ，每个稀释度接 2 孔， 37 孵育 过夜。rbIFN­子处理组和病毒对照组加入 100TCID50 的 VSV 病毒 100滋L 进行攻毒，对照组加入维持液（210农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年（每块 96 孔板均设细胞对照组、病毒对照组和 rb­ 。细胞继续培养 12

20、d， IFN­子处理组）在倒置镜下 观察结果， 待病毒对照组细胞全部发生明显病变时， 将抑制 50%细胞病变的干扰素最高稀释度作为 1 个单位。 1.7rbIFN­ 对牛子宫内膜上皮细胞的影响在四孔细胞培养板中接种第 4 代牛子宫内膜上图 1.基因的PCR产物byPCR 37 继续培养 48h。当细胞汇合度达到 60 皮细胞，%70%时， 去除培养液。将含 rbIFN­子的 PBS 与细 胞培养基等体积混合 （rbIFN­子终浓度为 2.9， 加入培养孔中； 对照组中加入 PBS 与细胞 滋g/mL) Fig.1.

21、Theamplificationproductof M,DNAladdermarkerDL20001, 培养基等体积混合液。细胞在 37 、 饱和湿度和 5 （Olym­ %CO 2 条件下继续培养 24h，用倒置显微镜pusIX70,Japan） 观察细胞形态并显微照相。2 结果和分析2.1基因的克隆 PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，出现 分子量为 585bp的特异性条带 （图 1）。将此扩增产 得到重组质粒， 命名为 物与 pGEM­T 载体连接后，pGEM­。采用不同的内切酶进行

22、酶切验证， 结果如图 2， 酶切片段与预期大小一致。DNA 测序 结果表明， 扩增序列与已知序列 （XM­593584） 相比， 核苷酸和氨基酸的同源性分别达 99%和 97%。氨基 酸序列比对结果如图 3。图 2. 重组质粒 pGEM­Fig.2.Analysisof 玉3,4,/酶切鉴定图谱 genefragmentin plasmid /2,/M,DNAladdermarkerDL2000+150001,5,CK,plasmid.图3.bIFN­子( 含信号肽) 的氨基酸同源性比对Fig.3.Homologyinami

23、noacidsofbIFN­子(withsignalsequence)toXM­593584  A， bIFN­子测序后翻译的氨基酸序列； B， GenBank中的已知序列 （XM­593584） 翻译后的氨基酸序列。 A,aminoacidsequenceofbIFN­子after beeningsequencedB,aminoacidsequenceofXM­593584inGenBank. 2.2基因原核表达载体的构建从鉴定正确的重组质粒 pGEM­上扩增含 pET­分

24、别在 25 和 37 条件下，的表达菌诱导表达后的蛋白条带与 pET­30a（+） 空 均无特异性蛋白条带产生。 而含 载体和诱导前相比， pET­（-在约 20kD处均有 1 条较粗的条带产生， 分子量 后，与预期大小一致 （图 6）。在低温条件下培养高水平 表达外源蛋白的大肠杆菌，可以在一定程度上抑制含信号肽和不含信号肽的 基因。与 pET­30a（+） 载体连接后， 酶切鉴定结果如图 4 和图 5， 片段 大小均与预期结果一致。这表明已成功构建了 bIFN­子的两种原核表达载体。 2.3bIFN­ 的原核表达及纯化第 2期 高方

25、方等：牛干扰素­tau基因的原核表达及生物功能鉴定211包涵体的形成，但从图 7 中也可以看出， pET­（-（25 ）、 低速诱导 20h 后， rbIFN­子仍以包涵体形式存在的。因此，后续表达条件选择 37 、 1伊10  ­4 mol/LIPTG 诱导 4h。由于 pET­+）rbIFN­子是不含信号 肽的成熟蛋白。Bradford 法测定 rbIFN­子的浓度为5.8 滋g/mL 。 图4.酶切验证图谱Fig.4.Analysisof genef

26、ragmentinplasmid M,DNAladdermarkerDL2000+150001, /2, /3, 域/4, 5, 玉6,plasmid.图 5.-Fig.5.Analysisof genefragmentinplasmid M,DNAladdermarkerDL2000+150001, /2, /3, /4, 5, CK,-plasmid采用 Ni 2+亲合层析在活性条件下得到了rbIFN­子， SDS­PAGE 电泳检测如图 8，其纯度在 90%以上。 2.4rbIF

27、N­ 的抗病毒活性检测当 rbIFN­子稀释 10 倍时，rbIFN­子处理组细胞与对照组相比，rbIFN­子仍可抑制 50%以上的细胞 图6.原SDS­PAGE图谱Fig.6.SDS­PAGEproductsof+and(原expressedinBL21(DE3) M,pre­stainedproteinmarker1,(+totalbacteriallysate (uninduced)2,totalbacteriallysate(uninduced)3, 25(+totalbacterial

28、lysate(IPTG­induced)4,25, ( totalbacteriallysate(IPTG­induced)5,37  , (+ totalbacteriallysate(IPTG­induced)6,37  , totalbacteriallysate(IPTG­induced)7,pET­30a(+) control.图 7.pET­的原核表达产物SDS­PAGE图谱Fig.7.SDS­PAGEp

29、roductofin M,pre­stainedproteinmarker1,37  ,totalbacteriallysate (uninduced)2,7,25,totalbacteriallysate(IPTG­induced)3,25 , solublefraction4,25,insolublefraction(inclusionbodies)5,37 , totalbacteriallysate(IPTG­induced)6,37 ,solublefraction

30、8,37 , insolublefraction(inclusionbodies).图 8. 纯化后的 SDS­PAGE电泳图谱 Fig.8.SDS­PAGEanalysisof purifiedrbIFN­子 M,pre­stainedproteinmarker1 and2,purifiedrbIFN­子. 212农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年rbIFN­子的最高稀释度为 1颐10发生病变， 因此， 结合  。 计算 rbIFN­子的抗病毒

31、活性单位为 rbIFN­子的浓度，9， b、 e）rbIFN­子处理组上皮细胞形态发生明显改变 ， 处理组 d、 f）（图 9， 。在光学显微镜下观察可以看到，（图 的贴壁细胞出现明显的、 大小不同的囊泡状结构 采用胰蛋白酶消 9， d） 而对照组的细胞形态无变化；且细胞内 化后， 可以发现处理组细胞体积明显增大， （图 9， f）容物增加 。1伊10  4 IU/mg。 2.5rbIFN­ 对牛子宫内膜上皮细胞的影响 在牛子宫内膜上皮细胞培养液中添加 2.9（图 rbIFN­子继续培养 24h 后， 与对照组相比 滋g/m

32、L 图 9. 培养液中添加rbIFN­子后对牛子宫内膜上皮细胞的影响Fig.9.EffectsofrbIFN­子on bovineendometrialepithelialcellsculturedinDMEMmediumsupplementedwith10%fetalcalfserum aandc.Thenormalmorphologiesofbovineendometrialepithelialcellscultured inthecontrolb.Afteradding0.01mol/LPBStomediumfor 2

33、4h,themorphologyofbovineendometrialepithelialcellswerethesameasthecontrold.Themorphologyofbovineendometrialepithelialcells, culturedinthemeidiumsupplementedby2.9滋g/mLrbIFN­子for24h,changedobviously,andalotofvacuolesappearedincellse.Thecell  morphologyinthecontrolafterbeingdigested

34、with0.25%trypsinfor5minf.ThecellmorphologyintherbIFN­子treatmentafterbeingdigestedwith 0.25%trypsinfor5min,thecellularvolumeswereoviouslylarger(arrow)thanthecontrolcells.Allimageswereinthesamemagnification. 3 讨论(2000)建立的奶牛单 本实验根据 Daniels 枚胚胎的 RT­PCR 方法的原理，不提取胚胎基因组 DNA，直接将引物加入

35、含有胚胎的裂解液中进行 PCR 扩增， 获得了 基因。该方法所需的胚胎 （5 枚）与常规 PCR 方法相 数量少 ， 操作方法简便， 比， 可以省略提取胚胎 DNA 的步骤， 具有省时和操 作简单的优点。采用原核系统表达真核基因，真核基因中信号 肽的存在可能会在一定程度上影响其表达产物的生 物活性(卢圣栋,1999)。 本实验构建含信号肽和不含 信号肽的原核表达载体，目的是比较两种表达产物实验结果表明， 含信号肽 的生物活性是否存在差异。而不含 序列的 基因不能在大肠杆菌中表达， 信号肽序列的且表达水平 则可以成功表达，基因不表达的原因较高。 含有信号肽序列的 性， 而 达过程中可能是由于原核

36、表达外源蛋白时具有密码子偏爱信号肽序列中可能含有较多的大肠杆基因不能正常翻译。 本实验室构建菌不利用或利用率低的密码子，最终导致在诱导表 在 BL21 DE3） 的含有 pET­（的大肠杆菌37 ， 1伊10 可以高水  ­4 mol/LIPTG 条件下诱导 4h， 并 平的表达 rbIFN­子。表达产物采用活性条件纯化，用 PBS 反复洗脱 3 次，得到的 rbIFN­子具有一定的 生物活性。第 2期 高方方等：牛干扰素­tau基因的原核表达及生物功能鉴定213LiandRoberts(1994)采用定

37、点突变的方法获得 10 种 C 端突变的 IFN­子类型， 并证明 IFN­子的突变影响抗病毒活性和抗细胞增殖活性。 同时，不同类型 IFN­子的抗病毒活性差异较大，本实验得到的rbIFN­子具有明显的抗病毒活性。此外， 培养液中添 加 rbIFN­子能明显引起牛子宫内膜上皮细胞体积和形态变化，但是其具体作用机制目前还不清楚。Munson  1991）在研究牛胚胎滋养层细胞和牛 子宫内膜上皮细胞的相互作用时也发现滋养层细胞 与牛子宫内膜上皮细胞共培养 48h 后， 子宫内膜上 皮细胞中出现大量的脂肪滴。这说明滋养层细胞可 能分泌某种因

38、子调控子宫内膜上皮细胞的脂肪代谢。Austin (2004)进一步比较了妊娠与空怀牛 子宫腔上皮、腺上皮和基质细胞的形态变化， 发现大 参 考 文 献 AustinKJ,CarrAL,PruJK,HearneCE,GeorgeEL,Belden ELandHansenTR.LocalizationofISG15andconjugated proteinsinbovineendometriumusingimmunohistochemistry andelectronmicroscopy(J). 2004,145(2): 967

39、975 CharpignyG,ReinaudP,HuetJC,GuillomotM,CharlierM, ErnalletJCandMartalJ.Highhomologybetweena trophoblasticprotein(trophoblastin)isolatedfromovine embryoand 琢interferons (J). 1988,228: 1216 DanielsR,Hall,VandTrounsonAO.Analysisofgene transcriptioninbovin

40、enucleartransferembryos reconstructedwithgranulosacellnuclei(J). 2000,63:10341040 EalyAD,GreenJA,AlexenkoAP,KeislerDHandRobertsR M.Differentovineinterferon­taugenesarenotexpressed identicallyandtheirproteinproductsdisplaydifferent activities(J). 1998,58:566573

41、 ImakawaK,AnthonyRV,KazamiM,MarottiKR,PolitesHR andRobertsRM.Interferon­likesequenceofovine trophoblastproteinsecretedbyembryonictrophectoderm(J). 1987,330:377379 LiJandRobertsRM.Structurefunctionrelationshipsinthe interferon­tau:Changsinreceptorbindingandinan

42、tiviral andantiproliferativeactivitiesresultingfromsite­directed mutagenesisperformednearthecarboxyl Terminus(J). 1994,269:2482624833 LuSD(卢圣栋).ModernMolecularBiologyLaboratory(M). Beijing:ChinaUnionMedicalCollegePress.1999.(in 量空泡样结构位于妊娠子宫腺上皮细胞核周围。这 说明子宫腺上皮细胞

43、在牛妊娠后出现活跃的物质合成活动，但它是否受 bIFN­子直接调控还无法确认。Staggs 1998）证明了体外重组 bIFN­子可以诱导原代培养的内膜上皮细胞表达 UCRP 和 GCP­2 两种蛋白，而 GCP­2只有在高浓度 rbIFN­子的条件下才能表达。Wang (2003)的研究又发现重组 IFN­子可以诱发 Bax­琢蛋白的表达， 并且， 随着添加 时间的延长 Bax­琢蛋白量不断增加。本实验的结果 显示，牛子宫内膜上皮细胞在 rbIFN­子的作用下体积明显增大， 说明此物质能促进细胞新物质