缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注早期核因子kB活性及细胞凋亡的

1、缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再灌注早期核因子kB活性及细胞凋亡的影响󰀀󰀀作者：庄永敬，曹云飞，吴桂荣，卢良声 作者单位：解放军421医院，广东 广州 510318；1.普外科，2.麻醉科 国家自然科学基金资助项目（C30000158）󰀀󰀀 【摘要】 目的 观察缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再灌注早期核因子kB活性、促凋亡基因Fas和FasL蛋白表达以及肝细胞凋亡的影响，以进一步阐明肝脏缺血预处理的抗凋亡作用机制。方法 建立SD大鼠肝缺血（40 min）再灌注（120 min）损伤及肝缺血预处理的模型。24只大鼠随机分成3组（n=8）。假

2、手术对照组（C组），仅分离肝十二指肠韧带，不阻断肝门，不进行其他干预处理。缺血再灌注组（IR组），在第一肝门用小血管夹阻断尾状叶及左肝叶血流40 min松开血管夹肝脏再灌注2 h，再灌注开始后关腹。缺血预处理组（IP组），先行3个循环的缺血预处理，阻断第一肝门10 min，开放再灌注10 min为1个循环，随后操作同缺血/再灌注组。实验结束后全自动生化分析仪检测血清谷草转氨酶和血清谷丙转氨酶活性；TUNEL法检测肝组织的细胞凋亡指数（AI）；EMSA法测定肝组织核因子kB的结合活性；Western blotting免疫印迹法检测Fas及FasL蛋白的表达水平。结果 IR组和IP组的ALT、AS

3、T及细胞凋亡指数（AI）均明显高于S组（P 0.01），但与IR相比，IP组则明显较低（P 0.01）。与C组比较，IR组的核因子kB活性、促凋亡基因Fas和FasL蛋白表达水平明显增高，而IP组仅轻度增高。结论 缺血预处理可通过降低肝脏缺血/再灌注早期核因子kB的转录活性，并下调促凋亡基因Fas及FasL的表达，从而发挥抗细胞凋亡和损伤保护效应。󰀀󰀀 【关键词】 缺血预处理；肝脏；再灌注损伤；核因子kB；凋亡；大鼠󰀀󰀀 Effects of ischemic preconditioning on cell apoptosis a

4、nd the activity of nuclear factor-kappaB induced by hepatic ischemia-reperfusion injury in rats ZHUANG Yongjing，CAO Yunfei，WU Guirong， et al. Department of General Surgery， PLA 421st Hospital， Guangzhou 510318 󰀀󰀀 Abstract Objective To explore the effects of ischemic preconditioning o

5、n cell apoptosis， activity of NF-kB， Fas and Fas-ligand expression induced by hepatic ischemia-reperfusion injury in rats， and to elucidate the underlying anti-apoptosis mechanism of ischemic preconditioning. Methods Experimental models of hepatic ischemia-reperfusion injury were established in adul

6、t healthy SD rats， twenty-four rats were randomized into three groups (n=8). (1)Sham operation group， only hepatoduodenal ligament was separated， porta hepatis did not be blocked up， without carrying out other interventional treatments. (2)IR group： the blood of caudate lobe and left lobes of liver

7、were blocked up for 40 minutes with small vessel clip at the first porta hepatis， then small vessel clip was taken away to recover liver reperfusion for 2 hours， at the same time， rat abdomen was closed. (3)IP group： the first porta hepatis was blocked up for 10 minutes followed by 10 minutes openin

8、g， referred to as a cycle， which was repeated for 3 times， sequent treatment was identical with I/R group The level of aspartate aminotransferase (AST)and alanine aminotransferase (ALT) in the serum of rats were detected with automatic biochemistry analyzer， the apoptosis index (AI) of hepatic cells

9、 was measured with TUNEL method， DNA binding activity of NF-kB in liver grafts was analyzed with EMSA (electrophoretic mobility shift assay)， and the Fas and Fas ligand expression in liver tissue was assessed with immunohistochemical method Results The levels of ALT， AST and AI were significantly hi

10、gher in IR group and IP group than that in S group (P 0.01)， and remarkable higher were also observed in IR group than those in IP group (P 0.01). Compared with C group， activity of NF-kB， Fas and Fas-ligand expression were significantly increased in IR group， while only modest increase was observed

11、 in IP group Conclusion Ischemic preconditioning can relieve the liver cellular apoptosis by regulating the activity of NF-kB， Fas and Fas-ligand expression， which may play a pivotal role in the preservation of liver cells in IP protection effect󰀀󰀀 Key words ischemic preconditioning；

12、 liver； reperfusion injury； nuclear factor-kappaB； apoptosis； rats󰀀󰀀 缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）对肝脏缺血性损伤的保护作用已得到了较多的研究证实，但其内在的分子生物学机制仍不清楚1-2。我们的前期研究表明，缺血预处理对大鼠肝脏的早期缺血再灌注损伤具有明显的抗凋亡保护作用，其机制与抑制促凋亡基因的高表达有关3，但对于缺血预处理调控促凋亡基因表达的胞内信号转导通路则尚未阐明。鉴于核因子kB在肝脏的缺血/再灌注损伤以及细胞凋亡相关基因的转录调控中起了重要的作用

13、4-5，推测核因子kB可能也是缺血/预处理抗肝细胞凋亡的重要作用靶位，但这一推测至今未得到证实。为此，我们拟通过观察缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再灌注早期核因子kB活性、促凋亡基因Fas和FasL蛋白表达以及肝细胞凋亡的影响，以进一步阐明肝脏缺血预处理的抗凋亡作用机制。󰀀󰀀1 材料和方法󰀀󰀀 1.1 材料󰀀󰀀 l0l2周龄的健康SD大鼠24只，雌雄各半，质量240280 g，由南方医科大学动物实验中心提供；Western LumiGlo试剂盒（美国Biolabs公司)；小鼠抗大鼠Fas及FasL抗体（

14、美国Sigma公司）；辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG（美国Santa Cruz公司）；原位细胞凋亡试剂盒（POD）购自德国Boehringer Mannhein公司；BECKMAN自动生化检测仪（美国BECKMAN公司）。󰀀󰀀 1.2 模型制作及分组󰀀󰀀 采用乙醚开放吸入麻醉，随机分3组（每组8只）。假手术组（control，C组）：大鼠成功麻醉，从尾静脉推注1 ml的肝素（50 U/ml）盐水。取上腹正中切口，进腹后分离肝十二指肠韧带，充分显露第一肝门部，但不阻断肝门，不施行缺血再处理和缺血/再灌注等处理。缺血再灌注组（I

15、R组）：开腹显露第一肝门后，用无损伤血管阻断夹阻断左肝以及尾状叶的血管造成70肝脏缺血，但不阻断右肝叶血流，以防门静脉和胃肠道瘀血。缺血时间40 min，再灌注时间120 min。缺血预处理组（IP组）：先行3个循环的缺血预处理（阻断第一肝门10 min，再开放10 min为1个循环)，随后的操作同IR组。󰀀󰀀 1.3 血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化󰀀󰀀 采用BECKMAN自动生化检测仪检测血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化。 󰀀󰀀 1.4 肝细胞凋亡指数（HAI）的测定󰀀&

16、#983040; 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的DUTP缺口末端标记法 (terminal deoxynucleotidyl transferase medicated d-UTP nick end labellng，TUNEL) 对肝凋亡细胞进行检测。按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。每例标本的切片随机选取10个视野（ 400），计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数表示作为肝细胞凋亡指数（hepatocyte apoptosis index，HAI）。凋亡细胞形态符合以下4点：单个细胞、周围无炎症反应、胞膜皱缩、胞核致密深染呈棕黄色颗粒。󰀀󰀀 1.

17、5 核因子kB结合活性的EMSA（electrophoretic mobility shift assay）测定󰀀󰀀 按我们既往已建立的EMSA法测定核因子kB结合活性6。提取左肝叶组织的核蛋白，置-70冻存备用。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用于核因子kB活性测定的两条寡核苷酸探针5 -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 及其互补链3 -TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5 由Sangon生物工程有限公司合成，聚丙烯酰胺纯化后， 采用?酌32PATP（北京亚辉生物工程公司）和T4多聚核苷酸激酶行5 末端标记，分装后置-20保存备用。结合反

18、应总反应体积20 ul，分别加入20 ug核蛋白、2 ug poly(dI-dC) poly(dI-dC)（Pharmacia Biotech公司）、4 ul 5 结合缓冲液50 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L NaCl，5.0 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L EDTA，5.0 mmol/L DTT，20%（V/V）甘油，冰浴10 min后加入标记探针3 ul，于室温下反应20 min，4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(120 V 3 h)后，80干燥（BIO-RAD凝胶干燥器）1.5 h，-70放射自显影。󰀀󰀀 1.6 Fas及FasL Western boltting蛋白印迹分析󰀀󰀀 取左肝叶组织约0.3 g加入细胞裂解液匀浆并裂解，用Sigma蛋白定量试剂作BSA蛋白定量，稀释各样品使蛋白含量在相同水平。取l0 ul样品上清液(含蛋白100 ug)，进行SDS-PAGE电泳。随后电转移至硝酸纤维素膜，分别与小鼠抗大鼠Fas及FasL抗体和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG反应，按Western LumiGlo显影系统试剂盒手册操作，X线胶片曝光、显像。󰀀󰀀 1.7 统计学方法b