实用,可行性高蛋白质的测定,氨基酸的测定

1、实用,可行性高蛋白质的测定,氨基酸的测定第一节第一节 概述概述一、一、propro组成与蛋白质系数组成与蛋白质系数1 1组成组成 pro pro是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物。分子化合物。元素组成百分比：元素组成百分比： C C H H O O N N S S P P百分比百分比 50 50 7 7 23 23 16 16 0-3 0-3 0-3 0-32 2蛋白质系数蛋白质系数 蛋白质系数即蛋白质系数即1 1份氮素相当于蛋白质的量。份氮素相当于蛋白质的量。 一般蛋白质含氮量为一般蛋白质含氮量为1616，即，即1 1份氮素相当于份氮素相当于6

2、.256.25份蛋白质份蛋白质 。二、氨基酸的组成二、氨基酸的组成 是由脂肪酸碳链上的氢原子被是由脂肪酸碳链上的氢原子被NHNH2 2所置换而得到的所置换而得到的。三、三、propro变性变性 引起引起propro变性的因素主要是热、酸和碱，化学试剂变性的因素主要是热、酸和碱，化学试剂、重金属盐等。、重金属盐等。 pro pro 发生变性作用后，溶解度降低，发生凝结，形发生变性作用后，溶解度降低，发生凝结，形成不可逆凝胶，成不可逆凝胶，- -SHSH暴露在外面。暴露在外面。四、测定意义四、测定意义1. 1. 蛋白质的测定意义蛋白质的测定意义(1) (1) 蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中

3、重要蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标。的营养指标。 (2) (2) 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。重要的意义。 2. 2. 氨基酸的测定意义氨基酸的测定意义 (1) (1) 了解食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基了解食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成；酸的构成；(2) (2) 指导食品加工工艺的改革、保健食品的开

4、发及合指导食品加工工艺的改革、保健食品的开发及合理配膳。理配膳。 第二节第二节 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法 （一）常量凯氏定氮法：（一）常量凯氏定氮法：1 1原理原理 常量凯氏定氮法是利用硫酸及催化剂与食品试样一常量凯氏定氮法是利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化使蛋白质分解，其中同加热消化使蛋白质分解，其中C C、H H形成形成COCO2 2及及H H2 2O O逸去，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在逸去，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。将消化液碱化，蒸溜，使氨游离，随水蒸气酸液中。将消化液碱化，蒸溜，使氨游离，随水蒸气蒸出，被硼酸

5、吸收。用盐酸标准液滴定所生成的硼酸蒸出，被硼酸吸收。用盐酸标准液滴定所生成的硼酸铵、从消耗盐酸标准溶液的量计算出总氮量。铵、从消耗盐酸标准溶液的量计算出总氮量。 (1) (1) 消化消化 (2) (2) 蒸馏：蒸馏： (3) (3) 吸收与滴定：吸收与滴定： 2 2适用范围适用范围此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。3. 3. 仪器仪器 凯氏烧瓶凯氏烧瓶(500(500mL)mL)、定氮球、漏斗、冷凝管定氮球、漏斗、冷凝管、锥形瓶、滴定管。、锥形瓶、滴定管。 4. 4. 试剂试剂(1) (1) 浓硫酸浓硫酸(2) (2) 硫酸钾：提高溶液的沸点，加快有机

6、物的分解。硫酸钾：提高溶液的沸点，加快有机物的分解。H H2 2SOSO4 4和和K K2 2SOSO4 4的添加量的添加量 1 1g g样品样品 K K2 2SOSO4 4：H H2 2SOSO4 4=7g=7g：12mL 12mL (3) (3) 硫酸铜硫酸铜：起催化作用，加速氧化分解；也是蒸馏起催化作用，加速氧化分解；也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分解液呈时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀。蓝色不生成氢氧化铜沉淀。(4) 40%(4) 40%氢氧化钠氢氧化钠(5) (5) 混合指示剂混合指示剂 甲基红甲基红溴甲酚绿混合指示剂：溴甲酚绿混合

7、指示剂： 5 5份份2 2g/Lg/L溴甲酚绿溴甲酚绿9595乙醇溶液与乙醇溶液与1 1份份2 2g/Lg/L甲基红乙甲基红乙醇溶液混合均匀。终点为灰红色。醇溶液混合均匀。终点为灰红色。 或甲基红或甲基红亚甲蓝混合指示剂：亚甲蓝混合指示剂： 一体积的亚甲蓝（一体积的亚甲蓝（0.05%0.05%酒精溶液）和二体积的甲酒精溶液）和二体积的甲基红指示剂（基红指示剂（0.05%0.05%酒精溶液）的混合物。终点为紫色酒精溶液）的混合物。终点为紫色。 (6) (6) 饱和硼酸溶液（饱和硼酸溶液（4040g/Lg/L）：）： 称取称取2020g g硼酸溶解于硼酸溶解于500500mLmL热水中，摇匀备用。

8、热水中，摇匀备用。N N盐酸标准溶液盐酸标准溶液5. 5. 测定方法测定方法 (1) (1) 样品消化：样品消化： 准确称取约相当于准确称取约相当于30-30-4040mggmgg研细的硫酸铜、研细的硫酸铜、3 3g g硫酸硫酸钾及钾及2020mlh mlh (2) (2) 蒸馏、吸收：蒸馏、吸收： 装好蒸馏装置装好蒸馏装置冷凝管冷凝管下端浸入接收瓶液面之下端浸入接收瓶液面之下下凯氏烧瓶内加入凯氏烧瓶内加入100100mLmL蒸馏水、玻璃珠蒸馏水、玻璃珠数粒数粒加入加入7070ml400g/Lml400g/L氢氧化钠氢氧化钠直火加热蒸直火加热蒸馏馏3030min min 将蒸馏装置将蒸馏装置出

9、口离开液面继续蒸馏出口离开液面继续蒸馏lminlmin，用蒸馏水淋洗尖用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏端后停止蒸馏 (3) (3) 滴定：将接收瓶内的硼酸液用滴定：将接收瓶内的硼酸液用0.0.lmollmolL L盐酸标盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白 6. 6. 结果计算：结果计算：式中式中 w w蛋白质的质量分数，蛋白质的质量分数，% %； c c 盐酸标准液的浓度，盐酸标准液的浓度，molmolL L； V V1 1空白滴定消耗标准液量，空白滴定消耗标准液量，mlml； V V2 2试样滴定消耗标准液量，试样滴定消耗标准液量，mlml； m m样品质量

10、，样品质量，g g：氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmolg/mmol； F F蛋白质系数。蛋白质系数。（二）微量凯氏定氮法（二）微量凯氏定氮法原理原理 2. 2. 仪器仪器 (1) 100(1) 100mlml凯氏烧瓶凯氏烧瓶(2) (2) 微量凯氏定氮器微量凯氏定氮器 (1) 100(1) 100mlml凯氏烧瓶凯氏烧瓶(2) (2) 微量凯氏定氮器微量凯氏定氮器3. 3. 试剂试剂(1) 40(1) 40g/Lg/L硼酸溶液。硼酸溶液。(2) 400(2) 400g/Lg/L氢氧化钠。氢氧化钠。(3) 1(3) 1g/Lg/L甲基红乙醇溶液与甲基红乙醇溶液与1 1g/Lg/L溴甲酚

11、绿乙醇溶液，溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按临用时按1:51:5混合。混合。mol/Lmol/L盐酸标准溶液。盐酸标准溶液。(5) (5) 其他试剂同常量法。其他试剂同常量法。4. 4. 测定方法测定方法 样品消化步骤同常量法。样品消化步骤同常量法。 将冷却后消化液转入将冷却后消化液转入l00mll00ml容量瓶定容至刻度，摇匀容量瓶定容至刻度，摇匀装好微量定氮装置装好微量定氮装置移取消化稀释液移取消化稀释液1010mlml于反应管内于反应管内加入加入l0ml40l0ml40氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液进行水蒸汽蒸馏至吸收进行水蒸汽蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏液中所加的混合指

12、示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏1010分钟后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏分钟后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏lminlmin，用蒸馏水用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。mol/Lmol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时作一空白盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时作一空白试验。试验。5 5结果计算结果计算（三）半微量凯氏定氮法：（三）半微量凯氏定氮法： 1 1原理原理2 2试剂试剂3. 3. 仪器：仪器： (1) 100(1) 100毫升凯氏烧瓶毫升凯氏烧瓶(2) (2) 半微量凯氏定氮装置半微量凯氏定氮装置 4. 4. 操作方法操作方法 样品消化步骤同常量法。样品

13、消化步骤同常量法。 将冷却后消化液转入将冷却后消化液转入l00mll00ml容量瓶定容至刻度，容量瓶定容至刻度，摇匀摇匀装好半微量定氮装置装好半微量定氮装置移取消化稀释液移取消化稀释液2525mlml于于反应管内反应管内加入加入l0ml40l0ml40氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液进行水蒸汽进行水蒸汽蒸馏至馏出液蒸馏至馏出液5050毫升左右（连吸收液共毫升左右（连吸收液共6060毫升左右）毫升左右）即可。即可。 mol/Lmol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时作一盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时作一空白试验。空白试验。5 5结果计算：结果计算：第三节第三节 氨基酸态氮的测定氨基酸态氮的测

14、定 一、双指示剂甲醛滴定法一、双指示剂甲醛滴定法1 1原理原理 双指示剂甲醛滴定法是利用氨基酸含有氨基及羧基双指示剂甲醛滴定法是利用氨基酸含有氨基及羧基这两性基团，他们相互作用而形成中性的内盐，加入甲这两性基团，他们相互作用而形成中性的内盐，加入甲醛与氨基起反应而使羧基游离出来，显示出酸性，再用醛与氨基起反应而使羧基游离出来，显示出酸性，再用氢氧化钠标准溶液滴定羧基，间接求出氨基酸态氮的量氢氧化钠标准溶液滴定羧基，间接求出氨基酸态氮的量。其反应方程式如下：。其反应方程式如下： 2 2试剂试剂(1) 200(1) 200g/Lmol/Lg/Lmol/L氢氧化钠滴定至呈淡蓝色）。氢氧化钠滴定至呈淡

15、蓝色）。mol/Lmol/L氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。(3) 1(3) 1g/Lg/L百里酚酞百里酚酞9595（体积分数）乙醇溶液。（体积分数）乙醇溶液。(4) 1(4) 1g/Lg/L中性红中性红50%50%（体积分数）乙醇溶液。（体积分数）乙醇溶液。 3. 3. 测定方法测定方法 移取含氨基酸约移取含氨基酸约2020mgmg的样品溶液的样品溶液2 2份，分别置于份，分别置于250250mlml锥形瓶中，加锥形瓶中，加5050mlml水，其中水，其中lmol/Llmol/L氢氧化钠滴氢氧化钠滴定至琥珀色为终点，另一份加入定至琥珀色为终点，另一份加入3 3滴百里酚酞指示剂滴百里酚酞指

16、示剂及中性甲醛及中性甲醛1010mlml，摇匀，静置摇匀，静置1 1minmin，mol/Lmol/L氢氧化钠氢氧化钠滴定至淡蓝色为终点。记录两次滴定所消耗的碱液毫滴定至淡蓝色为终点。记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。升数。4 4结果计算结果计算式中式中 w w氨基酸态氮的质量分数；氨基酸态氮的质量分数； C C氢氧化钠标准溶液的浓度，氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/Lmol/L； V V1 1用中性红作指示剂滴定消耗氢氧化钠标用中性红作指示剂滴定消耗氢氧化钠标准溶液的体积，准溶液的体积，mlml； V V2 2用百里酚酞作指示剂滴定消耗氢氧化钠用百里酚酞作指示剂滴定消耗氢氧化钠标准溶液的体积，

17、标准溶液的体积，mlml；氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmolg/mmol m m 测定用样品溶液相当于样品的质量，测定用样品溶液相当于样品的质量，g g。 二、电位滴定法二、电位滴定法1 1原理原理 此法是利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨此法是利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的甘汞电极基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的甘汞电极及玻璃电极插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准及玻璃电极插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，根据酸度计指示溶液滴定，根据酸度计指示pHpH值控制终点。值控制终点。2 2试剂试剂(1) 200(1) 2

18、00h/Lmol/Lh/Lmol/L氢氧化钠滴定至呈淡蓝色）。氢氧化钠滴定至呈淡蓝色）。mol/Lmol/L氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。 3 3仪器仪器(1) (1) 酸度计。酸度计。(2)(2)磁力搅拌器。磁力搅拌器。(3)10(3)10mlml微量滴定管。微量滴定管。4 4测定方法测定方法(1) (1) 吸取含氨基酸约吸取含氨基酸约 20 20mgmg的样品溶液，于的样品溶液，于100100mlmlmlml。置于置于200200mlml烧杯中，加烧杯中，加6060mlmol/Lmlmol/L氢氧化钠标准溶液滴氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示定至酸度计指示pH8.2pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数，可计算总酸含量。升数，可计算总酸含量。mLmol/LmLmol/L氢氧化钠标准溶液继续滴定至氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH8.2pH8.2，记录消记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。耗氢氧化钠标准溶液毫升数。(3(3）取）取8080mlmolmlmolL L氢氧化钠调至氢氧化钠调至pHrnlmolpHrnlmolL L氢氧