第十章 重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选

1、重组重组DNADNA导入宿主细导入宿主细 胞与转化子的筛选胞与转化子的筛选? ? 第一节重组DNA向宿主细胞的导入 第二节转化子的筛选与鉴定 第三节目的基因序列测定第一节重组DNA向宿主细胞的导入一、转化二、通过接合作用传递质粒DNA三、通过转染/转导作用传递遗传物质一、转化:以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞1928年,美国的Oswald,Avery首次开展了肺炎球菌的转化试验感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产生机制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。转化作用就是一种基因型细

2、胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有 原生原生质体转化法；质体转化法； 化学转化法；化学转化法； 电穿孔法。 原生质体转化法原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。 化学转化法化学转化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。1.原理：将对数生长期的细菌在0下,用预冷的CaCl2溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加,菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内。用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌

3、体成球形，外源DNA被吸附，经短暂42热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达105-106，它与菌株（hsdR-).2.方法:（1）感受态细菌的制备（2）转化（1）感受态细菌的制备接种一环DH5于2mlLB中37，振荡过夜以约1%的接种量接入20mlLB中振荡培养约90至OD6000.2离心（5K，5）收集菌体加入预冷CaCl2（10ml100mM）冰浴20离心收集菌体加入100ul100mM预冷CaCl2混匀转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照10ulPBR322DNAlng100ulb阴性对照10ul2ul连接液100ulc阴性对照10ul100uld连接液转化组60ul

4、6ul连接液600ul（2）转化：0，在1.5ml离心管中按下表加入CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验冰浴30422（热休克）冰浴，2加37预热LB培养45表中a、b、c各取100ul/皿涂布（连接液转化组d梯度涂布I50ul2皿；II.500ul浓缩后2皿）37倒置培养过夜检查细菌生长情况电穿孔法原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。它比CaCl2法操作更简单，转化效率高（一般可达1091010个转化子gDNA）,不仅无需制备感受态细胞,而且适用于任何菌株。二、通过接合作用传递质粒DNAF质粒（F因子）又称性质粒,除了含有自我

5、复制基因外,还带有一套接合转移的基因,凡携有F质粒的细菌称F+菌株。不带有F质粒的细菌称F菌株。F+菌株（供体菌）一旦与F菌株（受体菌）发生接触，F+菌株可通过性菌毛将F质粒转给F菌株，使F-菌株转变成F+菌株。质粒由F+向F菌的转移过程叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系（Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传递质粒DNA,F+菌株可失去F质粒,F菌也可获得F质粒,其转移难以人为控制,又不稳定，通常不用作克隆载体。接合- F+FF+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient三、通过转染/转导作用传递遗传物质 转染转

6、染病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。 转导转导以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA,体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA导入宿主菌体内第二节转化子的筛选与鉴定一、利用遗传标志的表型特征筛选二、根据重组子的结构特征筛选一、利用遗传标志的表型特征筛选由载体提供的性状进行筛选 1.抗菌素抗性标记筛选 2.抗性基因的插入失活筛选 3.-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活筛选法及其-互补的原理根据插入基因的遗传性状进行筛选亮氨酸（Leu)缺陷菌在无L

7、eu培养基中不生长，当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。Ampicillin 抗性? yes yesTetracycline 抗性? No yesB X BBBXAmproriAmprTcroriAmprTcroripBR322Bbacktransfer of colonies+ampicillin+ ampicillin+ tetracycline这些克隆是有重组质粒的细菌编码编码b-半乳糖苷酶 IPTGX-gal(酶的底物酶的底物)lac promoter蓝色菌落IPTG可诱导lacZ形成肽链,该产物能与有缺陷的宿主细胞所编码的N-末端发生基因内互补，形成有活性

8、的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈现蓝色。当外源基因DNA片段插入多克隆位点后, 使其编码的肽链失去活性, 使其不能形成-互补, 因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。 非重组质粒非重组质粒: 不含有插入的 DNA蓝色菌落 重组质粒重组质粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落back非重组质粒非重组质粒重组质粒重组质粒-互补的原理所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过肽互补作用可呈现有功能的-半乳糖苷酶活性

9、,进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝,使菌落呈现出蓝色反应。然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ肽区段的多克隆位点后,就会阻断序列的读码结构,使其编码的肽失去活性,使重组子所在的细菌不能完成-互补,因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。此法又称蓝白筛选法。如图5-1二、根据重组子的结构特征筛选 1.重组子大小鉴别筛选菌落提取质粒单酶切电泳原质粒 2.酶切鉴定菌落提取质粒双酶切电泳原质粒 3.PCR筛选法能与插入基因片断两端互补的特异

10、引物,以少量抽提的重组子DNA为模板,进行PCR分析 4.原位杂交图5-3、5-4该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。 5.斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来,麻烦2)抽提纯化,蛋白质、杂DNA等减少,所以能得到更为确切的结果,既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。 6.Southernblot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段,而Southernblot杂交能将同源片断定位于基因同尾酶BamHI和BglIIAGATCTGGATCCTCTAGACCTAGGBglBamHIAGATCCTCTAGT4连接酶GAGATCCTCTAGG肺炎双球菌转化

11、实验第三节目的基因序列测定一、目的基因序列测定的意义 美国联邦国家人类基因组研究项目负责人弗朗西斯柯林斯博士在华盛顿隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。由美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，在人类揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长路上又迈出了重要的一步。 二、目的基因测序方法 酶法酶法双脱氧链的末端终止法双脱氧链的末端终止法 化学（裂解）法化学（裂解）法酶法酶法双脱氧链的末端终止法双脱氧链的末端终止法1.Sanger双脱氧末端终止法：因掺入dd-NTP的链不能再延长而形成不同长度的末端为A、G、C、T的片段。图5-52.Sanger双脱氧-M13体系测序法：采用M13噬菌体组装基因后，再由引物合成不同长度末端为A、G、C、T的片段图5-63.Sanger双脱氧-PUC体系测序法：类似M13体系，只是由PUC体系替代M13噬菌体，再由引物合成不同长度末端为A、G、C、T的片段。图5-7双脱氧M13体系DNA序列分析法M13含单链DNA，在细菌内形成双链环状DNA（RF）。成熟的噬菌体含单链DNA分泌到培养液中。双链DNA（RF）：克隆载体，按提取质粒方法从细菌中制备单链DNA：测序模板，从培养基的上清中提取目前常用的M13mp18图5-6 化学（裂解）法化学（裂