丙型肝炎病毒基因型与血清HCVRNA含量关系及与干扰素应答的研究

1、丙型肝炎病毒基因型与血清HCVRNA含量关系及与干扰素应答的研究【 摘要 】目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)基因型与血清HCV RNA含量的关系及其对干扰素应答的影响。 方法应用定量荧光PCR(Amplisensor-PCR)技术检测了135例不同基因型HCV感染的慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA含量，另对其中77例进行干扰素治疗并随访12个月以上。 结果HCV-型感染血清HCV RNA水平(107.83.4拷贝/ml)显著高于HCV-型感染(106.32.5拷贝/ml)(P0.01)，型感染的应答率(7/13，53.8%)显著高于型感染(20/64，31.3%)(P0.05)。应答组治疗前血

2、清HCV RNA含量(106.82.7拷贝/ml)显著低于无应答组(108.33.2拷贝/ml)(P0.01)。HCV RNA含量低于106.5拷贝/ml者，无论何种型别HCV感染均应答较好，而HCV RNA高于108.0拷贝/ml者则应答极差。 结论HCV基因型及病毒血症水平是预测干扰素疗效的重要因素，且后者比前者意义更大。型感染病毒血症水平较高可能是影响其疗效的原因之一。【 主题词 】肝炎，丙型丙型肝炎病毒核糖核酸丙型肝炎病毒基因型聚合酶链反应干扰素 The amount of HCV RNA in chronic hepatitis C patients with different H

3、CV-genotypes infections and their relationships to the response to interferon Zhang Fuchun, Tang Xiaoping, Cai Xiaoli, et al. Institute of Infectious Diseases, The Eighth People?s Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510060Abstract To investigate the relationship between HCV RNA quantification and HCV g

4、enotype and their predictive role on response to interferon therapy,serum HCV RNA was quantified in 135 chronic hepatitis C patients with different HCV genotypes infections by quantitative PCR based on Amplisensor assay.Seventy seven of them were treated with recombinant interferon alpha(IFN) for 16

5、 weeks and were followed for more than one year.It was shown that serum HCV RNA concentration in patients with HCV- infection(107.83.4 copies/ml) was significantly higher than that in patients with HCV- infection(106.32.5 copies/ml,P0.01).The sustained response(SR) rate to IFN in HCV- infected patie

6、nts(7/13,53.8%) was significantly higher than that in HCV- infected patients(20/64,31.3%,P0.05).HCV RNA level prior to treatment in patients with SR(106.82.7copies/ml)was significantly lower than that in patients without response(108.33.2 copies/ml,P0.01).Patients with HCV RNA level less than 106.5

7、copies/ml,no matter what genotype they had,got a higher SR rate.But patients with HCV RNA level more than 108 copies/ml got almost no response.Our results suggest that HCV genotype and HCV RNA level before treatment are the main factors to predict response to IFN therapy in patients with chronic hep

8、atitis C.The higher viremia of HCV- may be one of the reasons to explain the lower response rate.Subject words Hepatitis C HCV RNA HCV genotype PCR Interferon丙型肝炎病毒(HCV)存在不同的基因型。近年来国外研究报道，HCV基因型与疾病的自然史、疾病活动度、病毒血症水平及其对干扰素(IFN)应答可能存在一定关系。我们也对HCV基因型的地区分布，HCV基因型与疾病程度和感染途径的关系以及与干扰素疗效关系进行了报道1。但有关HCV基因型与病毒

9、血症水平及HCV RNA水平与干扰素应答的关系国内尚未见报道。为探讨HCV基因型别与血清HCV RNA含量之间的关系及HCV RNA含量与基因型对IFN应答的影响，我们采用定量PCR方法检测135例不同HCV基因型别的慢性丙型肝炎(慢丙肝)血清HCV RNA含量，并对其中77例慢丙肝进行了IFN疗效观察，考查HCV RNA含量与基因型及干扰素应答的关系。材料和方法1.病例选择：135例慢丙肝病人均为我院1992年7月至1995年12月收治的住院患者，其中男81例，女54例，年龄1465岁，平均 45.317.6岁。经血清学检查排除了现症甲、乙、丁、戊型肝炎病毒感染，血清抗HCV(美国Abbot

10、t二代酶联试剂)及HCV RNA均阳性，病程6个月以上。其中50例经肝活检证实诊断。2.HCV基因分型：采用特异引物分型PCR技术，按文献1进行。3.HCV RNA定量检测：采用美国Biotronics Tech公司的定量荧光PCR检测系统进行2，3。(1)主要试剂：HCV RNA阳性标准及定量荧光PCR扩增引物由美国Biotronics Tech公司提供，AMV逆转录酶、dNTP、Taq-DNA聚合酶，为Promega公司产品。HCV RNA阳性标准为纯化的病毒RNA，-70保存。(2)引物序列：逆转录引物为5-GACCCAACACTACTCGGCTA-3；不对称扩增引物为5-GAAAGCG

11、TCTAGCCATGGCGTTAGTA-3,扩增产物为HCV基因组5端非编码区211bp片段；信号扩增引物为5-CAGCCTCCAGGACCCCC-3,扩增产物为211bp片段内长度为66bp片段。(3)定量荧光PCR检测HCV RNA原理：其基本原理是根据荧光能量传递来检测两条互补配对核苷酸的双链结构。在设计的双链信号引物的两条互补链上，分别标记上荧光供体及受体，当这种信号引物处于双链互补结构时，荧光能量就可在荧光的供体及受体间传递，而产生荧光；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中的一条链参与到产物的合成中，荧光就消失。这种荧光强度的变化与反应中特异性扩增产物的量成比例关

12、系。因此，通过检测PCR反应体系中的荧光强度的变化，并依据纯化HCV RNA建立标准曲线，即可推算出样品中HCV RNA的含量。(4)实验步骤：HCV RNA抽提及定量检测按操作说明书进行。每次实验均设阳性、阴性及最大信号对照，每份标本取两孔均值计算结果。4.干扰素治疗及疗效判断：77例慢丙肝分为重组干扰素1(IFN1，上海生物制品研究所产品)和重组干扰素-2b(IFN-2b，美国先灵葆雅公司产品)治疗两组。51例接受IFN1治疗16周，每次300万单位，第14周每日1次，第516周每周3次；26例患者接受IFN-2b治疗16周，每次300万单位，每周3次。治疗后随访12个月以上。干扰素疗效判

13、断：治疗期间血清ALT降至正常，HCV RNA阴转，停药后1年以上ALT仍维持正常，且HCV RNA仍阴性者为应答(持续应答)，其余为无应答。结果1.HCV基因型与血清HCV RNA含量的关系：135例慢性丙肝病人血清HCV型感染为87.4%；型感染为10.4%，混合型(+)感染为2.2%。将不同基因型感染的血清HCV RNA含量进行比较，显示型感染者HCV RNA含量显著高于型感染(P0.01)。见表1。表1135例不同HCV基因型慢丙肝血清HCV RNA含量Table 1. Serum concentrations of HCV RNA among differentHCV genotyp

14、es in 135 patients with chronic hepatitis CHCV genotypeCasesHCV RNA levels(copies/ml)118107.83.4*14106.32.5+3107.63.1*Compared with ,P0.01;Bacause cases in group(+) are so less,statistical analysis are not available 2.干扰素持续应答组与无应答组血清HCV RNA含量比较：见表2。IFN1组与IFN-2b组的持续应答率分别为33.3%(17/51)和38.5%(10/26)，两组比

15、较差异无显著性。两种干扰素治疗应答组与无应答两组间性别、年龄、病程等有可比性。应答组治疗前血清HCV RNA水平106.82.7拷贝/ml显著低于无应答组108.33.2拷贝/ml(P0.01)。表2干扰素治疗应答组与无应答组HCV基因型及治疗前血清HCV RNA含量比较Table 2. Comparison of HCV genotypes and HCV RNA levels betweenresponder group and nonresponder group prior to IFN treatmentCasesIFN1IFN-2bHCV-HCV-HCV RNA level(cop

16、ies/ml)HCV-HCV-HCV RNA level(copies/ml)Responder27125106.53.1*82106.83.5*Nonresponder50304108.42.9142108.63.0*Compared with nonresponder,P0.01 3.血清HCV RNA含量及HCV基因型及IFN应答的关系：见表3。结果显示，HCV-感染应答率7/13(53.8%)明显高于型感染的应答率20/64(31.3%，P0.05)。血清病毒含量低于106.5拷贝/ml有29例，20例为基因型，其中12例为持续应答；9例是型，有6例持续应答，在这一组中型与型感染的应答

17、率比较差异无显著性(P0.05)。当病毒含量108拷贝/ml时，型20例中只有1例应答，型1例无应答。表3血清HCV RNA含量及HCV基因型与IFN应答的关系Table 3. Effectiveness of IFN related to quantification of HCV RNA and HCV genotypesHCV RNA level(copies/ml)HCV-HCV-No.R*(%)No.R(%)106.52012(60)96(66.7)106.5 108247(29.2)31(33.3)108201(5.0)10(0) Total6420(31.3)137(53.8)*

18、R:responders 讨论干扰素是治疗慢丙肝最重要的抗病毒药物，但由于其应答率低，且费用昂贵，所以寻找能预测IFN治疗效果的因素十分必要。研究表明，影响IFN疗效的因素较多，主要包括病毒相关因素和临床相关因素两个方面，且病毒相关因素即治疗前血清HCV RNA水平和HCV基因型显得更加重要4，5。我们研究表明，应答组治疗前血清HCV RNA含量显著低于无应答组，HCV-型感染疗效明显优于型感染，提示治疗前低水平血清HCV RNA含量及型感染是IFN应答良好的主要预测因素，与文献报道一致6，7。HCV基因型在预测IFN疗效上有较大意义，但有关引起不同型别疗效差异原因的报道尚少。国外报道型感染血

19、清HCV RNA含量显著高于型，推测可能是其对IFN应答反应低于型感染的原因之一8。我们对135例慢性丙型肝炎血清HCV RNA进行定量检测，发现HCV-型感染HCV RNA水平明显高于HCV-型感染，支持上述观点。此外，本研究还发现，虽然型感染血清HCV RNA水平较型高，但两者之间的相差幅度较国外报道小，这可能是解释本组中型感染应答率31.3%(20/64)高于国外的20%(28/141)6的原因之一。但由于本组型病例较少，需积累更多的资料才能作出更客观的评价。我们通过对不同血清HCV RNA水平感染者对IFN应答分析显示，当HCV RNA小于106.5拷贝/ml时，应答率较高，型与型感染

20、比较无明显差异；当血清HCV RNA大于108拷贝/ml时，应答率极低。表明无论是型或型感染，治疗前血清病毒含量低，则治疗效果好，反之疗效差，结果与国外报道相似8，9。由于血清HCV RNA含量与IFN应答的关系更为密切，因此，作者认为HCV RNA含量较HCV基因型对干扰素疗效预测价值更大。在实际工作中，除考虑病人临床情况及HCV基因型等因素外，应主要依据治疗前病毒血症水平来决定IFN治疗病例选择及治疗方案，对HCV RNA含量较低者，无论是型或型感染，均应尽早使用IFN治疗；而对HCV RNA含量较高的病人(尤其是大于108拷贝/ml)，则应调整治疗方案，采用联合用药，或加大IFN剂量及延

21、长疗程等措施来提高治疗效果。本课题受广东省重点攻关项目(编号94062)和广州市医药卫生青年基金(编号95004)资助作者单位：510060 广州市第八人民医院传染病研究所参考文献1唐小平，吴婉芬，袁小珍.丙型肝炎病毒基因分型及其与疾病程度、感染途径和干扰素疗效的关系.中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(2)92-95.2Wang CN,Wu KY,Wang HT.Quantitative PCR using the Amplisensor Assay.In“PCR primer:A Laboratory Manual”ed.Dieffenbach CW and Dveksler CS,

22、Cold Spring Harbor Laboratory Press.1995, p.193-202.3张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15(1)24-27.4Kanai K,Kako M,Okamoto H.HCV genotypes in chronic hepatitis C and response to interferon.Lancet,1992,3391543.5Yamada G,Takahashi M,Tsuji T.Quantitative HCV RNA and effect of interferon therapy in chronic hepatits C.Dif Dis Sci,1992,121926-1927.6Peignoux MM,Marcellin P,Pouteau M,et al.Pretreatment serum hepatitis C virus RNA levels and hep